向卓亞，夏 陳，朱永清，羅棵瀕，鄧俊琳，陳 建, ，施劉剛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610066；2.雅安市雅州恒泰茶業(yè)有限公司，四川雅安 625100）

雅安藏茶作為典型的黑茶產(chǎn)品，距今已有1300多年的歷史，被譽為藏族同胞的民生之茶[1]。藏茶屬后發(fā)酵茶，是以一芽五葉以內(nèi)的茶樹新梢為原料，經(jīng)過殺青、揉捻、渥堆、干燥等工序制成，在渥堆過程中多酚類化合物有大幅度的變化，以茶多酚為主的內(nèi)含成分發(fā)生氧化縮合，生成更復雜的化合物如茶褐素等產(chǎn)物，對藏茶的品質(zhì)具有重要作用[2?3]?；诓夭柚卸喾N活性成分，研究發(fā)現(xiàn)藏茶具有減肥降脂、抗氧化、助消化和調(diào)理腸胃、降血糖、降尿酸等生理功能[3?4]。

由于黑茶具有耐貯藏性，其陳放過程中將繼續(xù)發(fā)生以多酚類為主的一系列生化反應，從而形成陳茶的風味品質(zhì)。段紅星等[5]發(fā)現(xiàn)普洱茶隨存放時間的延長，茶多酚、氨基酸和咖啡堿呈減少趨勢。張春泉[6]發(fā)現(xiàn)安茶中兒茶素與茶黃素含量隨著貯存時間延長呈現(xiàn)降低趨勢。目前陳茶逐漸受到市場的追捧，年份較久的陳茶價格越高[7?8]。貯藏時間對雅安藏茶品質(zhì)的影響十分重要。到目前為止，貯藏時間對藏茶中主要活性成分影響尚未有系統(tǒng)全面的解釋，僅有學者對不同貯藏時間下藏茶滋味和風味成分的變化做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)貯藏時間越長，酯類、烯烴類及芳香類物質(zhì)的含量越高[9]。

基于此，本文選取了同一廠家、不同貯藏時間的雅安藏茶，對其茶色素、總多酚、總黃酮及其抗氧化活性變化情況進行比較，以期為藏茶后期貯藏及消費提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏茶樣品 供試藏茶共計3個（Z1-Z3），均購自于雅州恒泰茶業(yè)有限公司，常溫密封保存于濕度45%～60%的倉庫中，茶箱離地離墻15 cm，樣品信息如表1所示，茶葉樣品經(jīng)粉碎、過40目篩，得到樣品粉末后密封?18 ℃保存?zhèn)溆茫桓Ａ址?、乙醇、甲醇、鹽酸、氯化鉀、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉 分析純，成都市科龍化工試劑廠；標準品：沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、咖啡堿（CA）、表兒茶素（EC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）（純度≥98%），北京索萊寶科技有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SHA-B型恒溫振蕩器 常州金南儀器制造有限公司；TD-4Z型臺式低速離心機 四川蜀科儀器有限公司；Synergy HTX型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Gentrifuge 5180R型冷凍干燥機

表1 供試樣品來源信息Table 1 Sample source information

德國Eppendorf公司；UV-6100型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀、DAD檢測器 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶葉提取液制備 參照Feng等[10]的方法略做修改，稱取1 g茶葉粉，加入8 mL 80%甲醇（含1%甲酸）40 ℃超聲提取30 min，8000 r/min離心15 min，將上清液倒出備用，殘渣重復上述方法提取2次，合并3次提取液并定容至25 mL，即為茶葉提取液。

1.2.2 茶色素提取及測定 參照Huang等[11]的方法略作修改。準確稱取3 g（以干基計）茶粉于125 mL沸水中提取10 min。將50 mL水提物用50 mL乙酸乙酯進行萃取并振蕩5 min，得到4 mL乙酸乙酯層，用13 mL 95%乙醇定容至25 mL，得到溶液A（EA）。向25 mL乙酸乙酯層中加入25 mL 2.5%NaHCO3后振蕩30 s，靜止分層后，將4 mL乙酸乙酯層用95%乙醇定容至25 mL，得到溶液C（EC）。向2 mL水層中加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL超純水，用95%乙醇（15 mL）定容至25 mL，得到溶液D（ED）。25 mL水提物用25 mL 2.5%NaHCO3振蕩3 min，2 mL水相加入2 mL飽和草酸溶液和6 mL超純水，用15 mL 95%乙醇定容，得到溶液B（EB）。以上溶液（EA、EB、EC、ED）在380 nm下測量吸光度，并以95%乙醇作為空白對照。

式中：EA、EB、EC、ED為在380 nm下測量吸光度值；TFs，茶黃素，g/100 g；TBs，茶褐素，g/100 g；TRs，茶紅素，g/100 g。

1.2.3 總多酚測定 參照Zhang等[12]方法略做修改，取20 μL茶葉提取液，向其加入20 μL福林酚試劑，混合均勻后靜置5 min，隨后加入160 μL質(zhì)量分數(shù)為5% Na2CO3溶液，室溫下避光反應60 min后，在765 nm下測定混合液吸光值。以沒食子酸溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光值為縱坐標（y），繪制標準曲線。沒食子酸線性回歸方程為：y=0.0058x+0.027，R2=0.999，線性范圍2～175 μg/mL。

1.2.4 總黃酮測定 參照羅磊等[13]的方法略做修改，取20 μL茶葉提取液，加入80 μL蒸餾水和10 μL 25%（m/v）NaNO2反應6 min，隨后加入10 μL 10% AlCl3?6H2O反應5 min后，加入30 μL 1 mol/L NaOH和100 μL蒸餾水，于510 nm波長處測定吸光值。以兒茶素溶液濃度（μg/mL）為橫坐標（x），吸光值為縱坐標（y），繪制標準曲線。兒茶素線性回歸方程為：y=1.1832x+0.059，R2=0.994，線性范圍0～200 μg/mL。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 ABTS自由基清除能力測定 參照Cheng等[14]方法略做修改。取20 μL茶葉提取液，加入20 μL蒸餾水和160 μL ABTS溶液，混勻避光反應6 min，于734 nm處測定吸光值。以水溶性VE的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），清除率為縱坐標（y），制作標準曲線，得到回歸方程：y=12.895x+0.0363，R2=0.998，線性范圍為0.0～19.5 μg/mL。以Trolox當量計算，測定結(jié)果以μg/g表示。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力測定 參照Tao等[15]方法略作修改。取40 μL 茶葉提取液，加90 μL 80%甲醇（含1%甲酸），再加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻，避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值。以質(zhì)量濃度為橫坐標（x），清除率為縱坐標（y），制作標準曲線，得到回歸方程：y=0.9472x?2.95，R2=0.996，線性范圍為5.94～95.00 μg/mL。以Trolox當量計算，測定結(jié)果以μg/g表示。

1.2.6 多酚類化合物測定 茶葉提取液中多酚類化合物分析測定采用高效液相色譜法，參照鄧俊琳等[16]的方法稍作修改。將茶葉提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析。色譜柱：Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；DAD檢測器；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流量：0.3 mL/min；進樣量1 μL；流動相：1%甲酸-水溶液（A），乙腈（B），洗脫條件：0～2 min，B：5%～10%；2～10 min，B：10%～20%，10～15 min，B：20%～40%；15～17 min，B：40%～70%；17～20 min，B：70%～95%。

標準品溶液的制備：分別取9個標準品20 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL作為標準品母液。以二倍稀釋法用甲醇將各標準品母液配制成一系列濃度梯度的標準品溶液，高效液相色譜待測。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，得線性方程如表2所示。

樣品中多酚單體的含量計算公式如下：多酚單體含量（μg/g）=待測液中多酚單體濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果用平均值±標準差表示（n=3），采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較方法進行顯著性分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶色素含量比較

茶色素是發(fā)酵過程中茶多酚氧化的主要產(chǎn)物，包括茶褐素類、茶黃素類和茶紅素類，其中茶褐素類是其主體成分。茶色素對湯色、滋味以及功能性質(zhì)有重要的影響。目前對于茶色素的研究多集中在普洱茶和紅茶方面[11,17?18]，而對藏茶中茶色素的研究較少。不同貯藏時間下藏茶中茶色素含量變化情況見表3。隨著貯藏時間的延長，茶褐素含量持續(xù)顯著增加（P<0.05），而茶黃素含量持續(xù)顯著減少（P<0.05），貯藏10年后的藏茶中茶紅素開始顯著減少（P<0.05），這與甘甜等[9]的研究結(jié)果相一致。這可能由于后期貯藏過程中仍有部分多酚類物質(zhì)、茶黃素和茶紅素等進一步氧化聚合成茶褐素，使其進一步積累[19?20]。而茶黃素作為氧化聚合過程中的中間產(chǎn)物，一方面通過茶黃素氧化聚合進一步累積，另一方面茶紅素又將繼續(xù)被氧化聚合而減少[21]。因此，雅安藏茶在貯藏過程中，茶色素變化的總趨勢是茶黃素和茶紅素顯著下降，茶褐素大量積累。張春泉[6]同樣發(fā)現(xiàn)安茶在陳化過程中隨著時間的延長，茶褐素含量呈顯著的上升趨勢。目前研究發(fā)現(xiàn)茶褐素能降低肝臟脂肪酸合酶的活性，抑制肝臟合成脂肪，促進體內(nèi)甘油三酯的降解[4]，因此陳化時間延長利于藏茶中茶褐素進一步積累，增強藏茶保健功能。

表2 多酚單體的標準曲線Table 2 The standard curve of polyphenol monomers

表3 不同貯藏時間藏茶中茶色素含量變化Table 3 Changes of pigment content in Tibetan tea during different storage time

2.2 總多酚、總黃酮及抗氧化活性比較

不同貯藏時間藏茶中總多酚、總黃酮及抗氧化活性的結(jié)果見表4。隨著貯藏時間延長，藏茶中總多酚和總黃酮顯著降低（P<0.05）。其含量顯著降低可能有以下幾個方面原因：其一，酚類物質(zhì)性質(zhì)極其活潑，貯藏過程極易發(fā)生氧化作用，從而繼續(xù)氧化聚合生成新的化學物質(zhì)；其二，貯藏過程在微生物作用下產(chǎn)生各種酸性物質(zhì)，使兒茶素等被降解；其三，酚類物質(zhì)被在酶的作用下被降解為可被微生物利用的碳源[22]。薛晨[23]對不同貯藏時間普洱茶中主要化學成分研究表明，隨貯藏時間的延長，茶葉中的多酚類自動氧化加深，多酚類含量降低。而張春泉[6]研究發(fā)現(xiàn)不同年代的安茶中總多酚含量并無顯著差異，這可能與安茶中的茶多酚類物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。藏茶中多酚類化合物使其表現(xiàn)出生物活性，本實驗通過對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力來評價不同貯藏時間下藏茶的抗氧化性，結(jié)果顯示DPPH 試驗和ABTS 試驗的結(jié)果較一致，同時研究發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，DPPH自由基清除能力顯著減弱（P<0.05），而貯藏10年后ABTS自由基清除能力也顯著減弱（P<0.05），本實驗中抗氧化活性隨著貯藏時間的變化趨勢與總多酚和總黃酮的變化趨勢也基本一致，這表明醇提液的抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量有密切關(guān)聯(lián)。

2.3 多酚類化合物含量比較

多酚類化合物是藏茶品質(zhì)的重要活性成分，其含量變化對品質(zhì)的形成具有十分重要的作用。其中C和GA是茶葉中多酚類物質(zhì)的重要成分，C是茶多酚的主體成分，其含量與茶葉品質(zhì)有密切關(guān)系[24]。GA是茶多酚的重要組成單元，常與兒茶素的酚羥基以酯的形式連接，形成一系列酯型兒茶素衍生物[25]。而咖啡堿是茶葉苦味的主要呈味物質(zhì)[26]。不同貯藏時間下藏茶中多酚類化合物含量變化見表5，隨著貯藏時間的延長，藏茶中C和兒茶素單體（EGC、CG、ECG、EGCG、EC）含量顯著降低而GA含量顯著增加（P<0.05）。這可能由于藏茶在長期存放過程中，多酚類化合物發(fā)生氧化聚合形成茶黃素和茶紅素等成分，同時使得GA發(fā)生脫落導致其含量顯著增加[22]。越陳的藏茶中CA含量雖越低（P<0.05），但變化幅度較小，這可能與咖啡堿性質(zhì)穩(wěn)定、自身不容易降解和氧化有關(guān)。劉澤森等[27]同樣發(fā)現(xiàn)不同年份的六堡茶中咖啡堿含量變化無明顯趨勢。

表4 不同貯藏時間藏茶中總多酚、總黃酮及抗氧化活性變化Table 4 Changes of total polyphenols, total flavones and antioxidant activity in Tibetan tea during different storage time

表5 不同貯藏時間藏茶中多酚類化合物含量變化Table 5 Changes of polyphenols in Tibetan tea during different storage time

表6 藏茶中總多酚、總黃酮、多酚化合物、茶色素和抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of total polyphenols, total flavones, polyphenol compounds, tea pigments and antioxidant activities in Tibetan tea

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 多酚類化合物之間相關(guān)性分析 通過對不同貯藏時間藏茶中多酚類化合物的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，TBs與總多酚、總黃酮、C、CA、CG呈現(xiàn)顯著負相關(guān)（P<0.05），與EGC、EC、EGCG、ECG、TFs以及TRs呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)（P<0.01）。研究表明TBs是多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)物，主要由兒茶素在多酚氧化酶等酶作用下氧化形成鄰醌，進一步經(jīng)過氧化縮聚形成TFs和TRs，再進一步氧化聚合形成TBs[28]。這與凌萌樂等[29]發(fā)現(xiàn)普洱茶中茶褐素含量與茶多酚和兒茶素含量呈極顯著負相關(guān)結(jié)論相一致。

2.4.2 多酚類化合物與抗氧化活性相關(guān)性分析 由表6可知，通過對多酚類化合物與抗氧化活性等相關(guān)指標進行相關(guān)性分析可證實ABTS自由基清除能力與藏茶中總多酚、總黃酮呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P<0.01），與EGC、C、CA、EC、EGCG、ECG、TFs、TRs呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與DPPH自由基清除能力也具有極顯著正相關(guān)（P<0.01）（見表6）。此外，向麗敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)對茶葉抗氧化活性影響最大的是總多酚含量，接下來依次為總黃酮含量、茶黃素、茶紅素、茶褐素。

3 結(jié)論

本文通過對不同貯藏時間藏茶中茶色素、總多酚、總黃酮、多酚類化合物以及抗氧化活性的分析比較，發(fā)現(xiàn)不同年份的藏茶中主要活性成分含量、抗氧化能力相差較大，其中陳化時間越久，藏茶中總多酚、總黃酮以及兒茶素類化合物含量越低，而茶褐素含量越高。本實驗僅對三個貯藏時間段藏茶進行分析比較，未來可進一步延長貯藏時間，更加全面對陳化藏茶活性成分及抗氧化活性進行比較研究，以期為陳年藏茶的進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。