沈 敏，匡海鷗，劉曉青，張 創(chuàng)，繆曉青，楊文超,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建福州 350002；2.蜂產(chǎn)品加工與應(yīng)用教育部工程研究中心，福建福州 350002；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，云南昆明 650201）

蜂蜜中主要含有糖、水、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量氨基酸、有機(jī)酸、酶類、維生素、類黃酮及酚類物質(zhì)等。蜂蜜具有加快傷口愈合、抗炎、抑菌，以及治療胃腸道疾病、皮膚病、癌癥、心臟病等作用[1]。黑小蜜蜂一般生活在海拔1000 m以下的次生稀樹草坡的小喬木上，是熱帶經(jīng)濟(jì)作物的主要傳粉昆蟲（見圖1）。主要分布于南亞和東南亞以及我國的西南地區(qū)，在云南省分布于西雙版納、臨滄等北回歸線以南地區(qū)[2]。它們在樹枝上營造單一露天巢脾，巢脾近圓形，大小為177～334 cm2，具有極強(qiáng)的護(hù)脾性，屬野生蜂種。每群蜂一次可采集0.5～1 kg蜂蜜，一年可收獲蜂蜜2～3次。

DNA高通量條形碼技術(shù)（也稱DNA宏條形碼技術(shù)）具有測序速度快、成本低、高通量、混合測序和產(chǎn)出序列數(shù)據(jù)量大的特點(diǎn)[3]。目前，ITS2、18SrDNA、matK和質(zhì)體trnL基因可用于測定不同蜂蜜樣品的植物來源[4]。其中，ITS2基因在鑒定植物屬種上表現(xiàn)較好，可用于設(shè)計通用引物的保守區(qū)域、擴(kuò)增較簡單、能區(qū)分可變性大的物種[5]。蜂蜜的植物來源是影響蜂蜜理化特性、營養(yǎng)成分、質(zhì)量和應(yīng)用價值的主要因素，探究黑小蜜蜂蜂蜜的理化性質(zhì)和抑菌活性有必要開展蜂蜜植物來源的鑒定研究。

蜂蜜作為抑菌劑應(yīng)用已有悠久的歷史，抑菌活性的強(qiáng)弱與其物理性質(zhì)和化學(xué)成分緊密相關(guān)。蜂蜜是過飽和糖液，能夠?qū)?xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生滲透壓，使細(xì)胞脫水并抑制其生長和增殖[6?7]。同時，蜂蜜的弱酸性環(huán)境不適合細(xì)菌的生長[8]。另外，蜂蜜的抑菌活性也與過氧化氫相關(guān)[7]。葡萄糖氧化酶提供連續(xù)且緩慢釋放的H2O2，H2O2與FeS-側(cè)垂脫水酶反應(yīng)，使單核鐵蛋白失活并引起DNA損傷，具有抑菌的效果[9]。非過氧化物如酚類、蛋白質(zhì)等對蜂蜜的抑菌活性也有作用[10]。研究表明總酚含量高的蜂蜜，抑菌效果也較強(qiáng)[11?12]。一些蛋白質(zhì)如王漿主蛋白1、蜂防御素1、絲氨酸蛋白酶、葡萄糖脫氫酶同工型等也與蜂蜜的抑菌活性相關(guān)[13]。蜂蜜中還含有一些其他的抑菌物質(zhì)，例如在蘇格蘭蜂蜜樣品中發(fā)現(xiàn)的新型脂肪二酸糖苷衍生物可能與抑菌活性有關(guān)[10]。聞名遐邇的麥盧卡蜂蜜是意大利蜜蜂采集植物松紅梅（Leptospermum scoparium）花蜜釀造而成，甲基乙二醛（MGO）是麥盧卡蜂蜜中主要的抑菌因子，麥盧卡因子分級系統(tǒng)（UMF）反映麥盧卡蜂蜜中MGO的濃度，UMF等級高的麥盧卡蜂蜜抑菌性更強(qiáng)[14]。Mavric等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)其他蜂蜜樣品在稀釋到含水量為80%或以上時均未顯示抑制作用，但麥盧卡蜂蜜樣品依舊顯示出抑菌活性，表明新西蘭麥盧卡蜂蜜的抑菌活性強(qiáng)大且穩(wěn)定。因此實驗中將蜂蜜稀釋至水分含量90%來研究樣品蜂蜜的抑菌活性。

目前，國內(nèi)外對于野生蜂種蜂蜜，尤其是黑小蜜蜂蜂蜜的研究極少。研究黑小蜂蜜的理化性質(zhì)、蜜源植物和抑菌活性，可以為更好的認(rèn)識和利用黑小蜜蜂蜂蜜提供基礎(chǔ)。

圖1 黑小蜜蜂在巢脾上吸食蜂蜜（匡海鷗攝）Fig.1 Apis andreniformis sucking honey on comb (Photo: KUANG Haiou)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑小蜜蜂蜂蜜 2019年7月取自西雙版納勐臘縣；康維他?（Comvita ?）UMF5+、UMF10+和UMF15+麥盧卡蜂蜜 2019年8月購自新西蘭并郵寄回實驗室（詳見表1）；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC6538）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC8739） 購自廣東省微生物菌種保藏中心；紫色色桿菌（Chromobacterium violaceum，ATCC12472）

福建農(nóng)林大學(xué)園林藝術(shù)學(xué)院微生物實驗室提供；氫氧化鈉、鹽酸、碘、碘化鉀、乙酸鈉、冰乙酸、可溶性淀粉、瓊脂、氯化鈉、無水乙醇 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇 色譜純，默克公司；5-羥甲基糠醛標(biāo)品、果糖標(biāo)品、葡萄糖標(biāo)品、麥芽糖標(biāo)品、蔗糖標(biāo)品、胰蛋白胨大豆瓊脂 北京索萊寶科技有限公司；酵母提取粉、細(xì)菌蛋白胨 英國Oxoid（Fisher）公司；一次性培養(yǎng)皿 Biosharp Life Sciences；植物基因組DNA提取試劑盒（EasyPure?Plant Genomic DNA Kit） 北京全式金生物公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；2×Hieff? Robust PCR Master Mix、Hieff NGSTM DNA Selection Beads 上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen）。

AR124CN型萬分之一分析天平、ST3100C型電導(dǎo)儀 奧豪斯儀器有限公司；WP-UP-LH-20型純水機(jī) 沃特浦公司；LC-20A型高效液相色譜 日本島津株式會社；UV759CRT型紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限責(zé)任公司；WYA型阿貝折射儀、WG-DCZ型低溫恒溫槽、WSC-S測色色差計上海申光儀器儀表有限公司；JB-2A型恒溫攪拌器上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PHs-3c PH計 廈門精藝興業(yè)有限公司；BPML-150F型生化培養(yǎng)箱、BPG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HYG-B型全溫度搖瓶柜

太倉市實驗設(shè)備廠；臺式離心機(jī)、超微量紫外分光光度計、Qubit?3熒光計 Thermo Fisher Scientific；漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；電泳儀電源、電泳槽 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)上海復(fù)日科技有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；PCR儀 BIO-RAD伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；臺式高速大容量冷凍離心機(jī) 德國艾本德公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 在實驗室小心的從黑小蜜蜂蜂巢（不含幼蟲、死蜂）中擠壓出蜂蜜，并經(jīng)過200目紗網(wǎng)過濾去蜂蠟、雜質(zhì)等，隨后保存在食品級塑料瓶中，樣品放置于4 ℃貯存，待測。

1.2.2 理化指標(biāo)的測定

1.2.2.1 水分 根據(jù)AOAC[16]的方法測定蜂蜜的水分。使用阿貝折射儀在40 ℃下測定折光率，計算相應(yīng)的含水量。

1.2.2.2 灰分、pH和酸度 根據(jù)Akram等[8]的方法測定灰分、pH和酸度。稱取5 g（精確到0.001 g）樣品至坩堝中，碳化至無煙狀態(tài)后放置于馬弗爐中以600 ℃焚燒12 h，直至完全灰化，冷卻后稱重，計算灰分含量。在250 mL燒杯中用75 mL無CO2的H2O溶解10 g樣品。磁力攪拌器不斷攪拌該溶液，pH計測定。隨后用0.05 mol/L的NaOH溶液在5 mL/min的速度下將該溶液滴定至pH8.50，立即用移液管移10 mL的0.05 mol/LNaOH溶液，再立即用10 mL的0.05 mol/LHCL溶液滴定至pH8.30。并根據(jù)以下公式計算游離酸和內(nèi)酯酸：

1.2.2.3 糖類葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖含量 根據(jù)劉曉華等[17]的高效液相色譜法測定。稱取試樣1 g（精確到0.001 g）于50 mL容量瓶，加水定容至50 mL，充分搖勻，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液，后續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶備用。液相色譜條件為：流動相：乙腈:水=70:30（V:V）；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；示差折光檢測器條件：溫度40 ℃。按照以下公式計算糖含量：

表1 樣品信息Table 1 Information of honey samples

式中：X表示試樣中糖（果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖）的含量，單位為g/100 g；ρ表示樣液中糖的濃度，ρ0表示空白中糖的濃度，單位為mg/mL；V表示樣液定容體積，單位mL；n表示稀釋倍數(shù)；m表示試樣的質(zhì)量，單位為g；1000、100均為換算系數(shù)。

1.2.2.4 淀粉酶活性 根據(jù)劉曉華等[17]的方法測定。稱取5 g試樣（精確到0.1 g），置于20 mL燒杯中，加入15 mL水和2.5 mL乙酸鹽緩沖液后，移入含有1.5 mL氯化鈉溶液的25 mL容量瓶中并定容，配制樣品溶液。溶解2.000 g可溶性淀粉于90 mL水中，迅速煮沸后再微沸3 min至室溫后，移至100 mL容量瓶中并定容，配制淀粉溶液。分別吸取5.0 mL淀粉溶液和 10.0 mL水于40 ℃水浴中15 min。后將淀粉溶液倒于10.0 ml水中充分混合，再取1.0 ml加到10.0 mL的碘溶液中混勻，用一定體積的水稀釋后，以水為空白對照，用分光光度計于660 nm波長處測定吸光度，確定產(chǎn)生0.760±0.02 吸光度所需稀釋水的體積數(shù)，并以此體積數(shù)作為樣品溶液的稀釋系數(shù)。淀粉溶液稀釋至總體積46 mL。吸取5 mL淀粉溶液、10 mL樣品溶液和10 mL碘溶液，分別置于40 ℃水浴中15 min。然后將淀粉溶液倒入樣品溶液中并以前后傾斜的方式充分混合后開始計時。5 min時取1 mL樣品混合溶液加入10 mL的碘溶液中，用水稀釋至46 mL并用相同的方式充分混勻，以水為空白對照，660 nm波長處測定吸光度，重復(fù)該步驟直至吸光度小于0.235。以吸光度（%）為縱坐標(biāo)，時間（min）為橫坐標(biāo)，將所測的吸光度與其相對應(yīng)的時間在對數(shù)坐標(biāo)紙上標(biāo)出，連接各點(diǎn)劃一直線。從直線上確定樣品溶液吸光度為0.235時相對應(yīng)的時間，結(jié)果按下式計算：

式中：X表示樣品溶液中的淀粉酶值，單位為mL/（g·h）；t表示相對應(yīng)時間，單位min。

1.2.2.5 5-羥甲基糠醛（5-HMF）含量 根據(jù)劉曉華等[17]的方法測出。稱取10 g試樣（精確至0.1 g），溶于10 mL甲醇，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，蒸餾水定容，充分混勻后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。色譜條件為：色譜柱：C18柱；流動相：甲醇:水=10:90；流速：1 mL/min；檢測波長：285 nm；柱溫：300 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。5-HMF含量按照下式計算：

式中：X表示試樣中5-HMF含量，單位為mg/kg；C表示從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，單位μg/mL；V表示定容體積，單位為mL；m表示樣液所代表試樣的質(zhì)量，單位為g。

1.2.2.6 電導(dǎo)率 根據(jù)權(quán)英等[18]方法測定。相當(dāng)于20 g無水蜂蜜加水定容至100 mL，在20 ℃條件下使用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，單位為ms/cm。

1.2.3 植物來源鑒定

1.2.3.1 分離花粉粒 取10 mL蜂蜜于50 mL的離心管中，加入40 mL水稀釋蜂蜜。56 ℃渦旋10 min，5000×g離心30 min，棄上清。加入25 mL水（保持在56 ℃水?。┲貞腋『?，5000×g離心15 min，棄去上清液。加入1 mL的50%乙醇重懸浮，將懸浮液全部轉(zhuǎn)移到2 mL的微量離心管中，12000×g離心15 min，棄去上清液，在56 ℃干燥45 min，得到蜂蜜中保留的花粉粒，用于后續(xù)DNA提取來確定蜂蜜的植物來源[5]。

1.2.3.2 提取花粉DNA 取20 mg從蜂蜜溶液中獲取的花粉粒，置于微量離心管中，在高通量組織研磨器中以65 Hz研磨10 s，重復(fù)六次，將花粉充分研磨后，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取花粉粒的DNA。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收及測序 采用ITS2通用引物，正向引物ITS2_F:ATGCGATACTTGGTG TGAAT，反向引物ITS2_R:TCCTCCGCTTATTGA TATGC[19]。在表2～表5的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行二次PCR后，Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1:1等量混合后，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機(jī)濃度為20 pmol。添加區(qū)分樣本的Barcode標(biāo)簽后，在IlluminaMiseq?平臺上進(jìn)行雙向測序。

表2 第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 2 The first PCR amplification reaction system

表3 第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Table 3 Protocol of the first PCR amplification reaction

表4 第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 4 The secondary PCR amplification reaction system

表5 第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件Table 5 Protocol of secondary PCR amplification reaction

1.2.4 抑菌活性

1.2.4.1 活化細(xì)菌 無菌環(huán)境下，無菌水充分溶解細(xì)菌凍干粉制成懸浮液，將其全部均勻的涂抹在固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基密封后在37 ℃下培養(yǎng)直至長出菌落。用接種環(huán)挑取菌落，涂抹在新的固體培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)，如此重復(fù)三次，將細(xì)菌活化復(fù)壯，用于后續(xù)實驗。

1.2.4.2 配制培養(yǎng)基 稱取5.0037 g蛋白胨、2.5031 g NaCl、2.5078 g酵母提取粉，用超純水溶解并定容至500 mL，取20 mL分裝到250 mL錐形瓶中，加塞、包口，121 ℃滅菌15 min制成液體培養(yǎng)基。稱取40 g胰蛋白胨，用1000 mL超純水煮沸溶解，分裝20 ml到250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌15 min制成固體培養(yǎng)基。

1.2.4.3 抑菌試驗 根據(jù)Akram等[8]的方法稍作修改測定蜂蜜的抑菌活性。細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h，以無菌水稀釋至108cfu/mL，并取該溶液200 μL混合在胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，凝固后打孔（d=0.8 cm）。將稀釋至90%含水量的蜂蜜溶液取20 μL于每個培養(yǎng)基中的三個孔中。然后將這些平板在37 ℃下培養(yǎng)12 h。測量透明抑制區(qū)的直徑計算微生物抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用StatView版本5.0.1（SAS Institute Inc.1992～1998，NC，美國）對理化指標(biāo)及抑菌直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，顯著性水平為P<0.05。Qrigin 2019b版本9.6.5.169（OriginLab公司1991～2019，美國）繪制柱形圖，所有實驗進(jìn)行三次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

對花粉植物基因測序的原始序列進(jìn)行預(yù)處理，去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列。進(jìn)行操作分類單元（OTU）分類，在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇豐度最高的序列為該OTU中的代表性序列。代表性序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到OTU序列最佳比對結(jié)果，比對結(jié)果滿足相似度>90%且coverage>90%的序列用作后續(xù)分類。使用的數(shù)據(jù)庫為RDP數(shù)據(jù)庫http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)

UMF5+、UMF10+和UMF15+麥盧卡蜂蜜的水分含量分別為16.76±0%，17.39±0%，17.74±0%。三個黑小蜜蜂蜂蜜的理化指標(biāo)結(jié)果如表6所示。

黑小蜜蜂蜂蜜樣品的水分含量在26.610%～42.453%之間，樣品之間的差異顯著（P<0.05），AAH2含水量高達(dá)40%以上，顯著高于其余兩個樣品（P<0.05）。樣品的灰分含量差異顯著（P<0.05），范圍在0.220%～2.022%。蜂蜜呈酸性，pH在3.910～4.140之間，AAH2的酸度顯著高于AAH1和AAH3（P<0.05），因此也具有更高的游離酸和內(nèi)酯酸。樣品中葡萄糖和果糖含量差異顯著（P<0.05），作為蜂蜜中主要的糖類，比例占40%～60%，在AAH1中的含量顯著高于AAH2、AAH3（P<0.05）。蔗糖和麥芽糖含量較低，僅占不到2.5%，各樣品之間沒有顯著差異（P>0.05）。淀粉酶值差異顯著（P<0.05），AAH2的淀粉酶值很低，AAH1的淀粉酶值顯著高于AAH2和AAH3（P<0.05）。5-HMF含量在0.038%～1.079%之間，表明蜂蜜新鮮度較好。樣品的電導(dǎo)率在1.066～1.787 ms/cm之間，樣品之間差異顯著（P<0.05）。樣品理化指標(biāo)的相關(guān)性見表7。

表6 黑小蜜蜂蜂蜜的理化指標(biāo)Table 6 Physio-chemical properties of Apis andreniformis honey

蜂蜜樣品的理化特性可用于評定黑小蜜蜂蜂蜜的品質(zhì)[4]。蜂蜜的含水量取決于成熟程度、生態(tài)因子（如溫度、氣候、空氣等）[20]、蜂巢溫度[8]、儲存條件以及植物來源和原始花蜜中的水分等。本實驗所用的黑小蜜蜂蜂巢在云南的雨季時期收集，整體含水量較高?；曳趾恐饕苤参飦碓春屯寥李愋偷挠绊慬8]。實驗所用的黑小蜜蜂蜂蜜是通過擠壓蜂巢過濾后獲取，攜帶較多花粉，使其灰分含量較高[21?22]。蜂蜜的酸度是由于有機(jī)酸，尤其是葡萄糖酸及其相應(yīng)的內(nèi)酯，以及無機(jī)離子（例如磷酸鹽、硫酸鹽和氯化物）的存在所致，酸度大小可以影響蜂蜜的抑菌活性[23?24]。前人研究表明蜂蜜的酸度與植物來源和收獲季節(jié)有關(guān)[25]?；曳趾退岫仍礁撸妼?dǎo)率越高，因此電導(dǎo)率差異與植物來源的有一定的相關(guān)性[22]。此外，花蜜中的糖分影響蜂蜜的糖含量[4]?？梢?，同一時間收獲同地點(diǎn)的黑小蜜蜂蜂蜜，植物來源不同引起其水分、灰分、pH和酸度以及電導(dǎo)率指標(biāo)的差異。

2.2 植物來源

同一時間和地點(diǎn)收集的黑小蜜蜂蜂蜜，AAH1、AAH2和AAH3分別檢測出27、71和19種植物來源，其中基因豐度>1%的植物分別有11、9、9種（如表8所示）。三個蜂蜜樣品沒有共有植物來源，AAH1和AAH2僅有一種共有植物來源：藍(lán)花野茼蒿（Crassocephalum rubens），基因豐度分別為16.16%和4.15%，AAH1和AAH3僅有一種共有植物來源：白飯樹（Flueggea virosa），基因豐度分別為2.06%和31.32%。

DNA高通量條形碼可以高效的鑒定蜂蜜的植物來源[26]，除上述基因豐度大于1%的植物以外，還有多種基因豐度較低的植物。但是實驗結(jié)果受蜂蜜中的植物來源受數(shù)據(jù)庫的影響較大，Lithocarpus vinhensis等未找到對應(yīng)中文名，可能是這一植物的基因組尚未列入所用的數(shù)據(jù)庫。三個樣品中植物來源的種類和數(shù)量有很大的差別。一方面說明了黑小蜜蜂的采集特異性較低，另外也可能與風(fēng)媒花粉有關(guān)[15]；植物來源不同是蜂蜜成分差異顯著的主要原因之一。

表7 蜂蜜樣品的理化指標(biāo)的相關(guān)矩陣Table 7 Correlation matrix of physio-chemical properties of honey samples

表8 黑小蜜蜂蜂蜜主要植物來源Table 8 Main plant’s sources of Apis andreniformis honey

續(xù)表 8

2.3 抑菌活性

2.3.1 對金黃色葡萄球菌的抑菌活性 蜂蜜樣品稀釋至90%含水量時，蜂蜜溶液對金黃色葡萄球菌抑菌活性差異顯著（P=0.0004）。按照抑菌活性強(qiáng)弱排序為AAH3>MH1>AAH1=MH3>AAH2>MH2。黑小蜜蜂蜂蜜溶液中，AAH3的抑菌活性顯著高于AAH1、AAH2。與麥盧卡蜂蜜相比，AAH3的抑菌活性顯著優(yōu)于麥盧卡蜂蜜（UMF5+、10+、15+）（P<0.05）。

2.3.2 對大腸桿菌的抑菌活性 蜂蜜樣品稀釋至90%含水量時，不同樣品對大腸桿菌的抑菌活性差異顯著（P<0.0001）。按照抑菌作用強(qiáng)弱排序為MH1>AAH3>AAH2=MH3>AAH1=MH2。AAH3與MH1的抑菌活性無顯著性差異。AAH1和AAH2與MH2、MH3的抑菌活性無顯著性差異。

2.3.3 對紫色色桿菌的抑菌活性 蜂蜜樣品稀釋至90%含水量時，各樣品之間對紫色色桿菌的抑菌活性差異顯著（P<0.0001）。按照抑菌活性強(qiáng)弱排序為MH3>MH1>AAH1>AAH3=MH2>AAH2。AAH2的抑菌活性顯著小于AAH1和AAH3（P<0.05）。AAH1和AAH3的抑菌活性顯著小于MH3（P<0.05），AAH1與MH1，AAH3和MH2蜂蜜溶液抑菌活性無顯著性差異。

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是兩種常見的胃腸道致病菌。紫色色桿菌在熱帶和亞熱帶地區(qū)水和土壤中常見，雖較少感染人類，但是一經(jīng)感染且未得到及時的治療，病死率極高[27]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)黑小蜜蜂蜂蜜對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和紫色色桿菌有良好的抑制效果，但是不同樣品的抑菌活性差異顯著。采收時間和花粉組成對蜂蜜抑菌活性有影響[28]，前人研究發(fā)現(xiàn)57種斯洛伐克不同蜜源植物來源蜂蜜對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性存在差異[29]。Liu等[30]的研究表明鬼針草（Bidens pilosa）蜂蜜由于具有較高的總酚和類黃酮的含量，顯示出比其他植物來源蜂蜜更強(qiáng)的抑菌效果。黑小蜜蜂蜂蜜樣品間不同的抑菌活性，是物理性質(zhì)和化學(xué)成分差異導(dǎo)致，理化性質(zhì)和化學(xué)成分的差異又與其植物種類密切相關(guān)。受限于蜂蜜的植物來源種類和數(shù)量差異較大，無法確定其具體的相關(guān)性。在實驗中發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜的抑菌活性并不依UMF等級升高而提高（圖2～圖4）。這可能是因為蜂蜜中MGO含量隨時間的變化引起的[14]。

圖2 90%含水量蜂蜜溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑Fig.2 Antibacterial diameters of 90% water content honey solution against S. aureus

圖3 90%含水量蜂蜜溶液對大腸桿菌的抑菌直徑Fig.3 Antibacterial diameters of 90% water content honey solution against E. coli

圖4 90%含水量蜂蜜溶液對紫色色桿菌的抑菌直徑Fig.4 Antibacterial diameters of 90% water content honey solution against C. violaceum

3 結(jié)論

采集自同一時間地點(diǎn)的黑小蜜蜂蜂蜜，植物來源差異顯著（P<0.05），不同植物來源影響蜂蜜的理化特性和抑菌活性。其水分、灰分、pH和酸度、葡萄糖含量、果糖含量以及淀粉酶活性、5-HMF含量、電導(dǎo)率差異明顯，麥芽糖和蔗糖差異較小。各樣品的植物來源種類和數(shù)量差異顯著（P<0.05），三個蜂蜜樣品沒有共有植物來源，AAH1和AAH2僅有一種共有植物來源藍(lán)花野茼蒿（Crassocephalum rubens），基因豐度分別為16.16%和4.15%，AAH1和AAH3僅有一種共有植物來源白飯樹（Flueggea virosa），基因豐度分別為2.06%和31.32%。黑小蜜蜂蜂蜜對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和紫色色桿菌具有良好的抑制效果，不同蜂蜜樣品的抑菌活性有差異。三個黑小蜜蜂蜂蜜中AAH3對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)且優(yōu)于麥盧卡蜂蜜，AAH3對大腸桿菌的抑菌活性與MH1麥盧卡蜂蜜無顯著差異且優(yōu)于其他蜂蜜，AAH1對紫色桿菌的抑菌活性最強(qiáng)，但是弱于MH3、MH1蜂蜜。

黑小蜜蜂具有治療金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和紫色色桿菌相關(guān)疾病的潛力，其臨床效果和量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。對黑小蜜蜂蜂蜜的抑菌活性起主要作用的植物種類有待進(jìn)一步研究；同時可能與黑小蜜蜂蜂蜜特有的動物源蛋白有關(guān)，其特有蛋白質(zhì)成分的分離鑒定及其抑菌效果、作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。