徐陽(yáng)鑫，高 雪，孫敏君，劉秀英，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013）

石墨烯量子點(diǎn)（Quantum Dots，GQDs）是一種準(zhǔn)零維納米材料[1?2]，相比于傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)，GQDs毒性更低、抗光漂白性更強(qiáng)[3?4]，因此在光電領(lǐng)域、食品檢測(cè)、生物醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛[5?9]。

革蘭氏陰性菌是臨床常見(jiàn)的致病菌[10]，因其細(xì)胞壁脂類(lèi)含量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜高而具有較強(qiáng)的耐藥性，可產(chǎn)生內(nèi)毒素，危害人體健康。大腸桿菌作為食源性致病菌，是其中的一種，無(wú)芽孢，周生鞭毛，可運(yùn)動(dòng)[11?12]。食用含大腸桿菌超標(biāo)的食物后，輕者會(huì)出現(xiàn)腹瀉等腸道疾病，重者會(huì)造成腸道出血甚至引發(fā)死亡，因此，其含量與人體健康密切相關(guān)。大腸桿菌的檢測(cè)方法很多，如平板計(jì)數(shù)法、PCR技術(shù)等[13]，但普遍存在弊端—操作繁雜、對(duì)專業(yè)技能要求高、檢測(cè)前需擴(kuò)增或富集，往往費(fèi)力費(fèi)時(shí)等[14?17]。GQDs具有寬的吸收光譜，并且其發(fā)射具有窄的帶寬依賴的局部最大值[18?20]。不同粒徑的GQDs可被單個(gè)波長(zhǎng)同時(shí)激發(fā)，此外，GQDs的熒光發(fā)射波長(zhǎng)可隨粒徑的不同而改變[21?23]。

粘菌素是一種環(huán)狀多肽抗生素，不僅對(duì)多重耐藥革蘭氏陰性菌具有顯著活性[24?25]，還具有有效的抗內(nèi)毒素活性[26?27]。革蘭氏陰性菌外膜能夠作為細(xì)胞的滲透屏障，控制物質(zhì)的進(jìn)出[28?29]，粘菌素能夠與其外膜中的脂多糖分子相互作用，引起細(xì)胞膜的紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30?32]。

本研究合成了氨基修飾的Fe3O4，將其與含羧基的GQDs結(jié)合，并用粘菌素修飾形成Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物[33?34]。存在不同濃度的Colis-Fe3O4-GQDs時(shí)，會(huì)存在猝滅現(xiàn)象，隨著濃度變大，猝滅效果越明顯；本實(shí)驗(yàn)基與此，建立了一種熒光探針檢測(cè)大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)方法，以期為致病菌快速檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC） 北京索萊寶科技有限公司；四水二氯化鐵 上海倍卓生物科技有限公司；六水三氯化鐵 北京百靈威科技有限公司；氨水 泰興市益民化工有限公司；3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTES）、粘菌素 阿拉??；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 深圳子科生物科技有限公司；大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、白喉?xiàng)U菌、肺炎雙球菌、破傷風(fēng)桿菌 均采集于錦州市科技路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，并于實(shí)驗(yàn)室分離。

PHS-3C pH計(jì) 上海BSNTE有限公司；S2020-M60-B-230 搖床 深圳CY-TECH有限公司；CMAG HS 7 磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；高壓蒸汽滅菌器 河南省三強(qiáng)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本HITACHI公司；IR Tracer-100 傅里葉紅外光譜儀 日本SHIMADZU公司；SK6210HP 超聲波清洗器 上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；VSM-100 振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì) 長(zhǎng)春英普有限公司；SU8020 場(chǎng)致發(fā)射掃描式電子顯微鏡 日本日立有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四氧化三鐵（Fe3O4）的制備 將0.86 g氯化亞鐵和2.36 g氯化鐵（FeCl3·6H2O）溶解于40 mL蒸餾水中，80 ℃的溫度下快速攪拌10 min。用25%的氨水調(diào)節(jié)至pH為9，繼續(xù)快速攪拌1 h，然后將溶液冷卻至室溫，最后加入去離子水，磁吸分離3次，干燥備用[35]。

1.2.2 氨基修飾的Fe3O4納米顆粒（NH2-Fe3O4）的制備 用乙醇和水將制備好的四氧化三鐵（Fe3O4）稀釋到50 mL，使分散效果更好，進(jìn)一步超聲30 min，加800 μL APTES到混合溶液中，室溫下攪拌8 h，加入無(wú)水乙醇磁吸分離兩次，最后用去離子水磁吸分離一次，除去溶液中的雜質(zhì)[36]。

1.2.3 Fe3O4-GQDs復(fù)合物的構(gòu)建 將制備好的NH2-Fe3O4固體添加2 mL蒸餾水超聲，混勻之后檢查磁性，放置待用。取1 mL GQDs分別加入0.002 g EDC和0.001 g NHS，振蕩30 min，觀察是否有沉淀生成，再加入NH2-Fe3O4振蕩，4 h后，將2 mL水加入到混合液中，磁吸洗滌分離2～3次，最后檢測(cè)其磁性[37]。

1.2.4 粘菌素與Fe3O4-GQDs的連接 用0.002 g EDC和0.001 g NHS活化500 μL預(yù)先制備的Fe3O4-GQDs復(fù)合物。室溫下培養(yǎng)30 min后，將200 μL粘菌素溶液（10?4mol/L）加入到配置好的混合溶液中。在室溫下反應(yīng)2 h，用去離子水進(jìn)行磁吸分離，Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物通過(guò)連續(xù)磁吸分離3次，除去未反應(yīng)的物質(zhì)。最后，將Colis-Fe3O4-GQDs 復(fù)合物分散在2 mL PBS（pH=7.4）溶液中。濃縮的溶液需穩(wěn)定一周后可以使用。

1.2.5 場(chǎng)致發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM） 將凍干的NH2-Fe3O4納米粒子置于導(dǎo)電膠樣品臺(tái)上，噴金，通過(guò)SEM顯微鏡在電流10 mA、電壓5 kV、工作距離5 mm的工作條件下對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行掃描[38]。

1.2.6 紅外吸收光譜分析 打開(kāi)紅外軟件的測(cè)定頁(yè)面，初始化儀器。將制備的溴化鉀壓片作為空白對(duì)照放入樣品倉(cāng)，點(diǎn)擊背景按鈕采集光譜，再將Fe3O4納米粒子和NH2-Fe3O4納米粒子放入樣品倉(cāng)分別進(jìn)行測(cè)定[39]。

1.2.7 磁力回線表征 采用磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定復(fù)合物納米粒子的磁滯回線，先打開(kāi)循環(huán)水，啟動(dòng)電腦中的測(cè)定軟件，預(yù)熱2 h，校準(zhǔn)后于室溫下測(cè)試樣品磁性能，設(shè)置測(cè)試范圍為?20000～20000 eV，將樣品放入樣品杯，開(kāi)始測(cè)量[40]。

1.2.8 革蘭氏陰性菌的檢測(cè) 將大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌株濃度。將200 μL預(yù)先制備的Colis-Fe3O4-GQDs溶液加入到2 mL PBS（pH=7.4）中稀釋10倍，在UV燈下活化1 h。將活化后的Colis-Fe3O4-GQDs濃縮溶液，按梯度依次稀釋，然后取1×102～10×102CFU/mL濃度的溶液檢測(cè)。將處理好的樣品在400 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 選擇性實(shí)驗(yàn) 為了充分研究Colis-Fe3O4-GQDs對(duì)革蘭氏陰性菌的選擇性，選取了鏈球菌、葡萄球菌、白喉?xiàng)U菌、肺炎雙球菌、破傷風(fēng)桿菌在同濃度下進(jìn)行選擇性實(shí)驗(yàn)。選擇性實(shí)驗(yàn)采用熒光猝滅程度F/F0作為縱坐標(biāo)、不同菌種的名稱作為橫坐標(biāo)對(duì)熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中，F(xiàn)0和F的分別為單純Colis-Fe3O4-GQDs 復(fù)合物及加入同濃度的不同菌種后的熒光強(qiáng)度。

1.2.10 檢測(cè)機(jī)制探究 用掃描電鏡分別表征被Colis-Fe3O4-GQDs 復(fù)合物孵育前后的大腸桿菌，通過(guò)對(duì)比孵育前后的大腸桿菌表面形貌差異，主要觀察其外觀是否發(fā)生形變，探究大腸桿菌與結(jié)合物之間的作用機(jī)制。選取 2 份 6×102CFU/mL 濃度的大腸桿菌，其中一份加入 Fe3O4-GQDs 結(jié)合物，另一份加入同體積的緩沖溶液，充分反應(yīng)后，將混合溶液離心，去除上清液，用 2.5% 的戊二醛固定 180 min，再用乙醇進(jìn)行梯度脫水。將混合物凍干后置于導(dǎo)電膠樣品臺(tái)上，噴金，通過(guò)掃描電子顯微鏡在電流 10 mA、電壓5 kV 工作距離、5 mm 的工作條件下對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行掃描[38,41]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 NH2-Fe3O4的表征

2.1.1 掃描電鏡表征 掃描電鏡圖（圖1）表明，合成的NH2-Fe3O4分布均勻整齊，大小均一，但有一定的聚集，所以每次使用前都需要進(jìn)一步做超聲均質(zhì)處理，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[42]。

圖1 NH2-Fe3O4掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of NH2-Fe3O4

2.1.2 紅外表征 如圖2，F(xiàn)e3O4粒子在580 cm?1處的強(qiáng)吸收峰對(duì)應(yīng)Fe-O特征伸縮吸收峰，此峰峰形完整，1630和3440 cm?1處的峰分別對(duì)應(yīng)-OH的彎曲振動(dòng)和伸縮振動(dòng)特征峰，表明Fe3O4磁納米粒子的成功合成。3-氨丙基三甲氧基硅烷作為一種硅烷偶聯(lián)劑，具有雙官能團(tuán)，既具有能與其他有機(jī)分子反應(yīng)的官能團(tuán)（如-COOH、-NH2、-SH），又包括能與無(wú)機(jī)納米顆粒反應(yīng)的Si-OH官能團(tuán)。NH2-Fe3O4納米粒子的Fe-O-Si特征吸收峰由于和580 cm?1處的Fe-O特征峰相重疊，所以并不能直接在紅外圖中得出，但可以間接通過(guò)3-氨丙基三甲氧基硅烷的特征吸收峰來(lái)判斷粘菌素是否成功偶聯(lián)到了納米粒子表面。N-H鍵在3420 cm?1處的伸縮振動(dòng)峰與-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰重疊，1100 cm?1是Si-O-Si的伸縮振動(dòng)吸收峰，890 cm?1對(duì)應(yīng)于-NH2的彎曲振動(dòng)吸收峰，1700 cm?1左右的吸收峰是由-NH2的基團(tuán)變形引起的，說(shuō)明粘菌素成功偶聯(lián)到了納米粒子表面[42?43]。

圖2 NH2-Fe3O4和Fe3O4的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of NH2-Fe3O4 and Fe3O4

2.1.3 磁力回線表征 如圖3所示，F(xiàn)e3O4的磁化曲線和退磁曲線相互重合，呈對(duì)稱的“S”型，當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度為0時(shí)，磁化強(qiáng)度也為0，說(shuō)明樣品在磁場(chǎng)中可以被磁化，當(dāng)磁場(chǎng)被去除后，樣品不再具有磁性，即合成的Fe3O4納米粒子具有超順磁性[38]。NH2-Fe3O4顆粒的飽和磁化強(qiáng)度相較于未經(jīng)修飾的 Fe3O4粒子略有下降，其原因可能是Fe3O4粒子經(jīng)氨基修飾后，表面原子與修飾分子的電子交換作用抑制了磁矩，進(jìn)而引起磁化強(qiáng)度的降低[44]。Fe3O4經(jīng)氨基修飾后的飽和磁化強(qiáng)度相對(duì)較高，表明其磁性較強(qiáng)。

圖3 NH2-Fe3O4和Fe3O4的磁力回線圖Fig.3 Magnetic loop diagram of NH2-Fe3O4 and Fe3O4

2.2 Fe3O4-GQDs納米復(fù)合物磁性能研究

圖4所示，F(xiàn)e3O4-GQDs納米復(fù)合物分散液在不同條件下的實(shí)物照片。從圖中可以看出，合成的納米復(fù)合物在去離子水中具有顯著的分散性。當(dāng)沒(méi)有外加磁場(chǎng)時(shí)，納米復(fù)合物可以均勻的分散在去離子水中，具有良好的分散性。當(dāng)加入一個(gè)外磁場(chǎng)時(shí)，納米復(fù)合物迅速的移向外加磁場(chǎng)的那一側(cè)，表明納米復(fù)合物磁性良好。

圖4 Fe3O4-GQDs納米復(fù)合物分散液在日光照射下無(wú)磁場(chǎng)吸附（a），日光照射下有磁場(chǎng)吸附（b）Fig.4 Fe3O4-GQDs nanocomposite dispersion without magnetic field adsorption under sunlight (a) and magnetic field under sunlight (b)

2.3 Fe3O4-GQDs與革蘭氏陰性細(xì)菌的熒光猝滅反應(yīng)

圖5所示，本實(shí)驗(yàn)利用熒光光譜研究了Fe3O4-GQDs與革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)合的能力。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中存在不同濃度的大腸桿菌時(shí)，F(xiàn)e3O4-GQDs的熒光猝滅程度隨細(xì)菌濃度的增大而變強(qiáng)，說(shuō)明其猝滅程度對(duì)濃度具有依賴性。當(dāng)大腸桿菌的濃度介于1×102～10×102CFU/mL時(shí)，線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=0.0184x+13.343，R2=0.999，檢出限為0.36×102CFU/mL。Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物表面上的粘菌素具有識(shí)別細(xì)菌的能力，并能夠有效結(jié)合革蘭氏陰性菌。粘菌素的脂肪酸側(cè)鏈可與革蘭氏陰性細(xì)菌表面上的脂質(zhì)A相互作用，破壞大腸桿菌的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致猝滅現(xiàn)象。

圖5 不同濃度大腸桿菌的Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜Fig.5 Fluorescence emission spectra of Colis-Fe3O4-GQDs conjugates with different concentrations of Escherichia coli

2.4 選擇性對(duì)反應(yīng)體系的影響

為了證明該實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，F(xiàn)e3O4-GQDs對(duì)其他陽(yáng)性菌進(jìn)行了干擾檢測(cè)。圖6所示，在相同的檢測(cè)條件下，在反應(yīng)體系中加入同濃度的Fe3O4-GQDs復(fù)合物。其中，鏈球菌、葡萄球菌、白喉?xiàng)U菌、肺炎雙球菌、破傷風(fēng)桿菌對(duì)Fe3O4-GQDs復(fù)合物的猝滅效率均在5%以內(nèi)，對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)幾乎沒(méi)有影響。因?yàn)檎尘匦揎椀腇e3O4-GQDs與革蘭氏陰性細(xì)菌表面上的脂質(zhì)A相互作用，其他陽(yáng)性菌不能被識(shí)別。此外，在其它革蘭氏陰性菌的干擾實(shí)驗(yàn)中，相同檢測(cè)條件下，布氏桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌對(duì)Fe3O4-GQDs復(fù)合物的猝滅效率遠(yuǎn)低于大腸桿菌。將以上三種革蘭氏陰性菌與大腸桿菌混合進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，干擾菌的存在不會(huì)影響大腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果。綜上所述，該實(shí)驗(yàn)方法對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)具有良好的特異性。

圖6 添加不同陽(yáng)性菌后的熒光變化Fig.6 Changes in fluorescence after adding different positive bacteria

2.5 檢測(cè)機(jī)制探究

圖7所示，分別顯示的用Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物孵育前后的大腸桿菌的SEM顯微照片，經(jīng)過(guò)對(duì)比，可以看出（圖中標(biāo)記部分），大腸桿菌經(jīng)Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物培養(yǎng)前表面飽滿，經(jīng)復(fù)合物孵育后的大腸桿菌表面干癟、皺縮，某些菌體表面出現(xiàn)了明顯的凹陷，說(shuō)明大腸桿菌經(jīng)Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物孵育后其結(jié)構(gòu)被破壞。粘菌素作為抗菌藥物，其抗菌機(jī)理主要是通過(guò)結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷酸鹽, 減小細(xì)胞膜的表面張力、增加其通透性, 致使胞漿外流,進(jìn)而導(dǎo)致大腸桿菌死亡[45]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)可以推斷量子點(diǎn)與粘菌素之間極有可能通過(guò)其中一個(gè)氨基基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)肽循環(huán)，根據(jù)粘菌素的抑菌機(jī)制，粘菌素的脂肪酸側(cè)鏈可與革蘭氏陰性細(xì)菌表面上的脂質(zhì)A相互作用，導(dǎo)致大腸桿菌的細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。Colis-Fe3O4-GQDs涂覆在大腸桿菌細(xì)胞壁的整個(gè)表面上，主要因?yàn)樗钦尘孛舾械募?xì)菌。通過(guò)觀察結(jié)果表明，該方法可以成功的創(chuàng)造附著在大腸桿菌表面上有效的Colis-Fe3O4-GQDs探針。

3 結(jié)論

圖7 加入Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物孵育前（a）后（b）的大腸桿菌的SEM顯微照片F(xiàn)ig.7 SEM microradiography of normal Escherichia coli before(a) and after(b) incubated with Colis-Fe3O4-GQDs complex

本實(shí)驗(yàn)合成了一種帶有強(qiáng)熒光的四氧化三鐵與石墨烯量子點(diǎn)的復(fù)合材料(Fe3O4-GQDs)，經(jīng)粘菌素修飾后，用以檢測(cè)大腸桿菌。大腸桿菌對(duì)Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物的熒光猝滅效應(yīng)可用于開(kāi)發(fā)革蘭氏陰性細(xì)菌傳感器，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)辟了革蘭氏陰性細(xì)菌的新方法，對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞可用于使用LPS-粘菌素相互作用進(jìn)行特異性識(shí)別。因此，大量的Colis-Fe3O4-GQDs復(fù)合物可同多種細(xì)菌結(jié)合，進(jìn)而引起熒光猝滅。該生物傳感器對(duì)于革蘭氏陰性菌檢測(cè)提供了新的方法，在細(xì)菌檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。