蘭 梅 張麗琴 胡靖鋒 徐學忠 楊紅麗 和江明

（云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所，國家蔬菜改良中心云南分中心，云南昆明 650205）

葉用芥菜（Brassica junceaCoss.var.foliosaBailey）原產(chǎn)于中國，簡稱葉芥菜，別名青菜、臘菜、春菜等，是十字花科蕓薹屬芥菜種中以葉片或葉球為產(chǎn)品器官的變種；喜冷涼濕潤氣候，適應性較強，品種繁多，長江流域以南地區(qū)栽培較為普遍（劉佩英，1996）。早在19 世紀80 年代，國際飲食營養(yǎng)及癌癥委員會（International Diets Nutrition and Cancer Committees）就建議多食用十字花科蔬菜，因為十字花科蔬菜富含具有化學預防特性的硫苷類物質(zhì)，可以預防癌癥。Fahey 等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基亞磺酰丁基硫苷（RAA）普遍存在于十字花科蕓薹屬蔬菜中，如芥菜、白菜、青花菜等，其水解產(chǎn)物萊菔硫烷（sulforaphane，SF）是迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強的物質(zhì)。流行病學和小鼠試驗結(jié)果表明，萊菔硫烷能夠顯著降低肝癌（Keck et al.，2003）、乳腺癌（Pawlik et al.，2013）、胃癌（Fahey et al.，2002）、前列腺癌（Cho et al.，2005）、結(jié)腸癌（Rong et al.，2003）、皮膚癌（Xu et al.，2006）等的發(fā)生幾率。當前對萊菔硫烷的報道多集中在青花菜上(何洪巨 等，2003；Liang et al.，2006；張嬋娟 等，2007），且有研究表明萊菔硫烷/RAA 含量與基因型密切相關(guān)（Farnham et al.，2004；Abercrombie et al.，2005；邱海榮 等，2008；謝祝捷 等，2010）。

混合分組分析法（bulked segregant analysis，BSA）又稱集群分離分析法，是一種快速檢測與目標性狀連鎖標記的方法（Michelmore et al.，1991），現(xiàn)已廣泛應用于動植物抗性基因、生長相關(guān)性狀的篩選、鑒定等（白素蘭 等，2000；嚴長杰 等，2000；Sun et al.，2009；Tripathi et al.，2009；史 明會，2013）。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定了葉用芥菜F2單株的萊菔硫烷含量，構(gòu)建F2混合分離群體（BSA）基因池，進行與萊菔硫烷含量基因連鎖的SSR 分子標記研究，以期為葉用芥菜新品種的選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎，亦為研究萊菔硫烷的分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試葉用芥菜材料由云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所十字花科課題組提供（表1）。20 份材料均于2017 年11 月1 日播種，播種60 d 后每份材料分別隨機選取3 株，取中心幼嫩葉片頂端部位，采用HPLC 法測定萊菔硫烷含量，得到1 份萊菔硫烷含量最高的葉用芥菜材料太樂四季青，含量為（226.72 ± 8.04）mg · kg-1；1份萊菔硫烷含量最低的材料圓葉春菜，含量為（11.79 ± 0.53）mg ·kg-1。以太樂四季青為母本，以圓葉春菜為父本進行雜交，2018 年4 月初收獲F1種子；6 月25 日加代播種F1，進行套袋自交，11 月收獲F2種子，得到葉用芥菜萊菔硫烷含量分離群體材料。

表1 參試20 份葉用芥菜材料的品種名稱及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 葉用芥菜F2萊菔硫烷含量的測定 2018 年12 月1 日播種100 份F2材料，播種60 d 后隨機選取80 個F2單株，分別取中心幼嫩葉片頂端部位，采用HPLC 法測定萊菔硫烷含量。

準確稱取0.20 g 樣品放入研缽中磨碎，加入pH 值為7.0 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol · L-1磷酸氫二鉀和0.1 mol · L-1磷酸二氫鉀）6.0 mL，37 ℃下酶解2.0 h，然后加入6 mL 乙酸乙酯（AR）繼續(xù)混勻30 min，4 000 r · min-1離心10 min，收集上清液；再重復提取2 次，將3 次收集的上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，旋蒸溫度為35 ℃；最后用6 mL 乙腈定容，過0.22 μm 濾膜后-20 ℃低溫保存待測。

采用Rigol L3000 高效液相色譜儀，紫外波長201 nm；色譜柱：Kromasil C18 反相色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；時間：30 min；流速：0.8 mL · min-1；進樣體積：10 μL；流動相的配制：將超純水1 000 mL、甲醇1 000 mL用0.45 μm 的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱，甲醇∶水=35V∶65V。

1.2.2 葉用芥菜親本、F2各單株DNA 的提取 以親本太樂四季青、圓葉春菜及80 份F2單株幼嫩葉片為材料，采用2×CTAB 法（稱取EDTA 7.44 g、Tris 12.1 g 和NaCl 81.8 g，溶于800 mL 超純水中，用HCL 調(diào)pH 至8.0；再加入20 g CTAB，加熱至60 ℃使之溶解，用超純水定容至1 000 mL，37 ℃條件下保存）分別提取DNA（Fu et al.，2006）。然后用1×TE 溶解稀釋DNA 至50 ng · μL-1，檢測DNA 的質(zhì)量。置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 混合池的構(gòu)建 根據(jù)Michelmore 等（1991）提出的BSA 法，從F2群體中選取高萊菔硫烷含量和低萊菔硫烷含量單株各10 株，分別取10 μL DNA 混合均勻，構(gòu)成高萊菔硫烷含量池（H）和低萊菔硫烷含量池（L），并分別檢測DNA 質(zhì)量。

1.2.4 PCR 擴增及產(chǎn)物檢測 根據(jù)蕓薹作物網(wǎng)（http：//www.brassica.info/tools/genetic_markers.html）公布的十字花科蕓薹屬共同引物和史明會（2013）關(guān)于青花菜中與RAA 含量相關(guān)的SSR 分子標記研究結(jié)果，合成50 對引物用于PCR 擴增。采用昆明碩擎生物科技有限公司提供的Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×），其中含有DNA polymerase、Buffer、dNTPs 等組分，添加上、下游引物和DNA 模板，利用梯度PCR 儀篩選引物退火溫度，最終得到適合葉用芥菜SSR 分析的體系（25 μL）：PCR Mix 22 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL。PCR 擴增反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，72 ℃再延伸1 min，35 個循環(huán)；最后于4 ℃保存。

取PCR 反應液5 μL，直接上樣，采用1%瓊脂凝膠電泳檢測，在Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)上進行觀察并拍照。

1.2.5 相關(guān)性驗證 將初步篩選得到的引物在與其相對應建立的F2高萊菔硫烷含量和低萊菔硫烷含量混合基因池中擴增，進一步確定篩選得到的引物具有穩(wěn)定遺傳的多態(tài)性。然后，再用篩選出來的引物在親本和F2分離群體中進行擴增，驗證其是否與萊菔硫烷目標性狀連鎖，初步得到與萊菔硫烷含量相關(guān)的SSR 標記及其引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用芥菜F2 單株的萊菔硫烷含量

從表2 可以看出，80 個葉用芥菜F2單株中，萊菔硫烷含量相對較高的10 個單株編號分別為50、38、5、57、4、68、32、59、40、55，萊菔硫烷含量相對較低的10 個單株編號分別為74、7、16、73、69、15、71、43、24、22。

表2 葉用芥菜F2 單株萊菔硫烷含量的測定結(jié)果

2.2 DNA 的檢測結(jié)果

2.2.1 親本及F2單株DNA 的檢測結(jié)果 供試葉用芥菜親本太樂四季青、圓葉春菜及80 個F2單株提取的DNA 均表現(xiàn)為條帶清晰、整齊，無拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA 質(zhì)量較好。利用核酸檢測儀檢測顯示，親本以及80 個F2單株DNA 樣品濃度在800～2 000 ng · μL-1之間，A260/280在1.8～2.0之間，所提取的DNA 質(zhì)量能夠滿足后續(xù)試驗的進行。

2.2.2 混合池DNA 的檢測結(jié)果 分別取10 個萊菔硫烷含量較高的F2單株的DNA 各10 μL，等量混合，構(gòu)成H 池；再分別取10 個萊菔硫烷含量較低的F2單株的DNA 各10 μL，等量混合，構(gòu)成L 池。利用核酸檢測儀檢測顯示，H 池DNA 濃度為92.5 ng · μL-1，A260/280為1.852；L 池DNA 濃度為86.7 ng · μL-1，A260/280為1.829?？梢詽M足后續(xù)的PCR 擴增。

2.3 引物的篩選

用50 對引物組合對葉用芥菜親本太樂四季青和圓葉春菜進行初步篩選，結(jié)果表明有16 對引物在雙親間表現(xiàn)出多態(tài)性；然后根據(jù)BSA 法構(gòu)建的高、低萊菔硫烷含量池進一步篩選，得到9 對多態(tài)性引物（圖1）。

2.4 多態(tài)性引物的驗證結(jié)果

將9 對多態(tài)性引物在高、低萊菔硫烷含量池的單株中進行驗證，最終得到2 個SSR 多態(tài)性標記SF12 和SF28，引物信息見表3 和圖2。

表3 2 個SSR 多態(tài)性標記的引物序列

SF12 和SF28 都是顯性標記，SF12 在父本圓葉春菜、低萊菔硫烷含量池L 和低萊菔硫烷含量池單株中均擴增出大小約為250 bp 的條帶，而在母本太樂四季青、高萊菔硫烷含量池H 和高萊菔硫烷含量池單株中相應位置未擴增出條帶（圖2-A、B）；SF28 在母本太樂四季青、高萊菔硫烷含量池H 和高萊菔硫烷含量池單株中均擴增出大小約為250 bp 的條帶，而在父本圓葉春菜、低萊菔硫烷含量池L 和低萊菔硫烷含量池單株中相應位置未擴增出條帶（圖2-C、D）。

M，BM 2000+DNA Marker；P1，太樂四季青；P2，圓葉春菜；H，高萊菔硫烷含量池；L，低萊菔硫烷含量池；H1～H10，高萊菔硫烷含量池單株；L1～L10，低萊菔硫烷含量池單株。

2.5 SF12 和SF28 在F2 群體中的擴增結(jié)果

由圖3 可知，SF12 在低含量萊菔硫烷親本圓葉春菜和F2部分萊菔硫烷含量相對較低的單株中擴增出條帶（圖3-A），而SF28 在高含量萊菔硫烷親本太樂四季青和F2部分萊菔硫烷含量相對較高的單株中擴增出條帶（圖3-B），進一步驗證了這2 對引物與葉用芥菜中萊菔硫烷含量性狀的相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)外對萊菔硫烷的醫(yī)學價值報道較多，對葉用芥菜中萊菔硫烷含量的研究鮮有報道。本試驗以2 個萊菔硫烷含量差異較大的葉用芥菜高代自交系為親本雜交得到的F2分離群體為研究背景，利用BSA 法并結(jié)合SSR 分子標記技術(shù)進行萊菔硫烷含量相關(guān)的分子標記篩選，初步確定了2 個與葉用芥菜中萊菔硫烷含量連鎖的標記。

當前對十字花科蔬菜萊菔硫烷的報道多集中在青花菜上，李占省等（2012）結(jié)合青花菜DH 群體花球中萊菔硫烷含量，最終獲得了與萊菔硫烷含量相關(guān)的13 個QTL，這些QTL 位點分布于4 條連鎖群上。史明會（2013）研究了青花菜中與RAA 相關(guān)的SSR 分子標記，得到4 個與萊菔硫烷的前體物質(zhì)RAA 相關(guān)基因緊密連鎖的多態(tài)性標記。本試驗測定了葉用芥菜葉片中萊菔硫烷的含量，結(jié)果顯示不同品種間含量差異較大，但本試驗沒有驗證不同時期葉用芥菜葉片中萊菔硫烷含量是否差異較大；本試驗雖然初步獲得了2 個與葉用芥菜中萊菔硫烷含量連鎖的標記，但由于F2群體較小，試驗結(jié)果的精確性可能會受到影響，有待進一步研究驗證。