時(shí)暢，孫冠男，王丹，王晗，顏久興

(1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070；2.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462；3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300070；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300193)

冠心病是一種常見心血管疾病，已成為許多國家的主要致死原因之一，其危險(xiǎn)因素包括高血壓、糖尿病、高膽固醇、吸煙、酗酒和抑郁等[1]。目前治療冠心病的藥物包括硝酸鹽、他汀類藥物、鈣通道阻滯劑和醛固酮受體拮抗劑，而這些藥物會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如頭暈頭痛、腎衰竭和心動(dòng)過緩等[2]。傳統(tǒng)中藥具有對(duì)機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)且不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，對(duì)于需要進(jìn)行長(zhǎng)期藥物治療的冠心病具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。冠心舒痛膠囊(GXSTC)作為傳統(tǒng)中藥方劑，由五味中藥材組成：廣棗，丹參，丁香，冰片和天竺黃，其中，廣棗為君藥，丹參為臣藥，丁香與冰片為佐藥，天竺黃為使藥，多年來一直用于治療冠心病[4]。然而，其具體作用機(jī)制尚不明確。冠心舒通膠囊中包含多種成分，并在體內(nèi)靶向多重靶點(diǎn)產(chǎn)生治療作用，這使得僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段來探索其作用機(jī)制過于復(fù)雜，并且效率低下。Hopkins最早提出將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種強(qiáng)大的藥物作用機(jī)制分析工具，它將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，并系統(tǒng)地分析網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)間的相互作用，這與傳統(tǒng)中藥通過多重靶點(diǎn)對(duì)病患機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)相一致[5-6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探究抗心血管疾病傳統(tǒng)中藥在分子水平上的多重藥理機(jī)制提供新的可能性。

1 材料與方法

1.1冠心舒通膠囊的化合物數(shù)據(jù)集建立與成分比較 依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/)；中醫(yī)藥資料庫(http：//tcm.cmu.edu.tw/)和相關(guān)文獻(xiàn)，檢索收集冠心舒通膠囊五味藥材中所含的化合物成分，同時(shí)獲取每個(gè)成分的藥理學(xué)性質(zhì)參數(shù)，包括相對(duì)分子質(zhì)量(MW)、氫鍵供體數(shù)目(nHDon)、氫鍵受體數(shù)目(nHAcc)、脂水分配系數(shù)(ALogP)、口服生物利用度(OB)、Caco-2細(xì)胞滲透性(Caco-2)和類藥性(DL)，并對(duì)各參數(shù)進(jìn)行類比分析。

1.2冠心舒通膠囊的候選化合物篩選 化合物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)性質(zhì)對(duì)于其在體內(nèi)發(fā)揮治療作用至關(guān)重要。此部分使用3個(gè)與ADME相關(guān)的指標(biāo)，分別為OB、Caco-2和DL，閾值分別設(shè)置為：OB≥30%，Caco-2≥-0.4和DL≥0.18[7]。滿足以上3個(gè)條件的化合物被篩選為候選化合物，然后將其輸入到化合物數(shù)據(jù)庫(PubChem Compound，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并獲取每個(gè)化合物的PubChem CID。

1.3冠心舒通膠囊的體內(nèi)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與篩選 通過中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)獲取上述候選化合物的體內(nèi)靶點(diǎn)。BATMAN-TCM是第一個(gè)專門用于中藥分子機(jī)制研究的在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)[8]。將由PubChem CID代表的候選化合物列表輸入BATMAN-TCM中，參數(shù)設(shè)置如下：Score cutoff≥20且P<0.05。符合參數(shù)要求的靶點(diǎn)被視為候選化合物的候選靶點(diǎn)。隨后將候選靶點(diǎn)輸入到治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)，PharmGKB數(shù)據(jù)庫(http：//www.pharmgkb.org)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：/ /www.uniprot.org)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(http：//www.drugbank.ca/)中，篩選與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)的靶點(diǎn)為潛在靶點(diǎn)，與之存在相互作用的化合物為潛在活性化合物。

1.4冠心舒通膠囊的網(wǎng)絡(luò)建立與分析 為了進(jìn)一步確定活性成分，體內(nèi)靶點(diǎn)與作用機(jī)制，利用Cytoscape 3.6.1構(gòu)建冠心舒通膠囊網(wǎng)絡(luò)[9]。具體如下：通過連接候選化合物與其對(duì)應(yīng)的候選靶點(diǎn)，建立候選化合物-候選靶點(diǎn)(candidate compound-candidate carget)網(wǎng)絡(luò)；將潛在活性化合物與其潛在靶點(diǎn)連接起來，構(gòu)建與冠心病治療相關(guān)的潛在活性化合物-潛在靶點(diǎn)(potential compound-potential target)網(wǎng)絡(luò)；連接潛在靶點(diǎn)與從TTD，PharmGKB和Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取的潛在靶點(diǎn)相關(guān)疾病，建立潛在靶點(diǎn)-疾病(potential target-disease)網(wǎng)絡(luò)。隨后利用網(wǎng)絡(luò)分析工具Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的兩個(gè)關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)“度(degree)”和“介度中心性(betweenness centrality)”進(jìn)行計(jì)算與分析?！岸取北硎驹诰W(wǎng)絡(luò)中與某節(jié)點(diǎn)相連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)目，“介度中心性”表示通過某節(jié)點(diǎn)的最短路徑的數(shù)量，這兩個(gè)參數(shù)的值越大，則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要[10]。有研究表明，與“介度中心性”比較，使用“度”這一參數(shù)更優(yōu)，并且在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，對(duì)“度”的應(yīng)用也更為廣泛[11-12]。

2 結(jié)果

2.1冠心舒通膠囊的化合物數(shù)據(jù)集建立與成分比較 通過上述數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)挖掘，共獲得384種化合物成分及其藥理學(xué)性質(zhì)參數(shù)，其中，廣棗包含43種化合物，丹參170種，丁香109種，冰片30種，天竺黃32種。對(duì)上述5味藥材所含化合物的藥理學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較分析，見表1。結(jié)果顯示廣棗與丹參這組成分在類藥性等多項(xiàng)藥理學(xué)參數(shù)接近度較高。見圖1。藥物分子的藥理活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征密不可分，而類藥性和ADME參數(shù)是藥物分子所具有的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)的綜合體現(xiàn)[13-15]。同時(shí)有研究表明廣棗和丹參可通過相似的作用機(jī)制產(chǎn)生明確的心血管保護(hù)作用，并且常被聯(lián)合應(yīng)用于心血管疾病的治療，這與冠心舒通膠囊中廣棗為君丹參為臣的配伍規(guī)則一致[16-20]。因此，筆者判斷廣棗和丹參具有相似的藥理學(xué)性質(zhì)。

表1 冠心舒通膠囊中五味藥材的藥理學(xué)性質(zhì)參數(shù)

2.2冠心舒通膠囊的候選化合物篩選 上述384個(gè)化合物中，有36個(gè)化合物符合設(shè)定的參數(shù)閾值。有6個(gè)化合物雖未達(dá)到設(shè)定閾值，但已有文獻(xiàn)證明他們具有冠心病治療作用，所以也被歸為候選化合物。這6個(gè)化合物分別為鞣花酸(M1)、沒食子酸(M43)、丹參素(M183)、原兒茶酸(M3)、冰片(M333)和異冰片(M325)。綜上所述，共計(jì)從冠心舒通膠囊中篩選出42個(gè)候選化合物進(jìn)行下一步研究，相關(guān)信息見表2。

表2 冠心舒通膠囊中的42個(gè)候選化合物與其藥理學(xué)性質(zhì)參數(shù)

2.3冠心舒通膠囊的體內(nèi)靶點(diǎn)信息 將用PubChem CID表示的42種候選化合物列表輸入到BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中，成功獲取到282個(gè)不重復(fù)候選靶點(diǎn)。利用TTD、 PharmGKB、Uniprot和Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選出了32個(gè)與冠心病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在靶點(diǎn)，見表3。與這32個(gè)潛在靶點(diǎn)存在相互作用的化合物有30個(gè)，即為冠心舒通膠囊中的潛在活性化合物。

表3 32個(gè)潛在靶點(diǎn)信息

2.4冠心舒通膠囊的候選化合物-候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立與分析 候選化合物-候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖1)中包含324個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中包括42個(gè)候選化合物和282個(gè)候選靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)分析表明，>64%候選靶點(diǎn)與≥2種候選化合物存在相互作用。如腫瘤壞死因子-α(TNF-α，T207)可以被脫氧新隱丹參酮(M148)，鐵氨酚(M157)，miltiononeI(M168)和1-hydroxy-2，8，8-trimethyl-6，7-二氫-5H-菲-3，4-二酮(M173)四個(gè)候選化合物調(diào)節(jié)。前列腺素合酶1(PTGS1，T17)，微粒體甘油三酸酯轉(zhuǎn)移蛋白亞基(MTTP，T3)和維生素K環(huán)氧還原酶復(fù)合物亞基1(VKORC1，T83)也分別與冠心舒通膠囊中多種成分存在相互作用。這說明冠心舒通膠囊具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)。

2.5冠心舒通膠囊的潛在活性化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立與分析 為進(jìn)一步研究冠心舒通膠囊對(duì)冠心病的治療作用機(jī)制，構(gòu)建潛在活性化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)，其包含62個(gè)節(jié)點(diǎn)(30個(gè)潛在活性化合物和32個(gè)潛在靶點(diǎn))。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，超過73.3%潛在活性化合物作用于兩個(gè)以上潛在靶點(diǎn)，有16種化合物節(jié)點(diǎn) “度”數(shù)值高于均值2.9，這16種化合物可能為冠心舒通膠囊治療冠心病的有效成分，見表4。除此之外，其中12種已被有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道具有抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡等生物活性。這表明冠心舒通膠囊可能通過發(fā)揮抗炎、抗氧化以及抗細(xì)胞凋亡作用對(duì)冠心病產(chǎn)生治療效果。

表4 16種“度”值高于2.9的潛在活性化合物信息

2.6冠心舒通膠囊的潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)建立與分析 在潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)中(圖3)，與32個(gè)潛在靶點(diǎn)相關(guān)的疾病有21種。其中大多數(shù)為心血管系統(tǒng)疾病，例如冠心病、高血壓、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化和高脂血病等。除此之外，阿爾茨海默癥作為一種神經(jīng)退行性疾病，也在網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵地位。這表明除冠心病外，冠心舒通膠囊還可用于治療阿爾茨海默病等多種疾病，為冠心舒通膠囊的其他可能臨床用途提供了新的方向。

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出冠心舒通膠囊中的有效成分與作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。通過進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，發(fā)現(xiàn)16種化合物的“度”數(shù)值高于平均水平，其中12種已被證實(shí)具有抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡活性。例如，槲皮素(M42)具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化活性，同時(shí)可以通過減少一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和白細(xì)胞介素(IL)-6的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用[21-22]。豆甾醇(M292)可以阻斷NF-κB通路以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)以及促炎遞質(zhì)前列腺素E2(PGE2)的釋放，發(fā)揮抗炎作用[23]。積雪草酸(M342)通過抑制線粒體依賴性細(xì)胞凋亡和阻斷TNF-α介導(dǎo)的凋亡來減輕心肌細(xì)胞的損傷，同時(shí)還可減少IL-1B，IL-6，IL-18和阻斷TNF-α等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]。這表明冠心舒通膠囊對(duì)冠心病的治療作用機(jī)制可能為抗炎、抗氧化與抗細(xì)胞凋亡。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果同時(shí)表明，拓?fù)鋮?shù)值最高的7個(gè)靶點(diǎn)為ESR1(T72)，PTGS2(T18)，PTGS1(T17)，VKORC1(T83)，MTTP(T3)，ESR2(T236)，TNF-α(T207)。這7個(gè)靶點(diǎn)可能為冠心舒通膠囊治療在體內(nèi)產(chǎn)生治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，PTGS2與類花生酸的合成有關(guān)，有助于產(chǎn)生促進(jìn)冠心病發(fā)生發(fā)展的炎癥環(huán)境[25]。TNF-α可以通過增加損傷組織中的炎性細(xì)胞，加劇心肌血管平滑肌重塑，同時(shí)對(duì)心肌產(chǎn)生負(fù)性變力作用，從而導(dǎo)致心肌纖維壞死和冠狀動(dòng)脈缺血[26]。這進(jìn)一步說明了冠心舒通膠囊是通過多種成分作用于多重靶點(diǎn)，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡作用對(duì)冠心病進(jìn)行治療的。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論注重調(diào)節(jié)患者機(jī)體的整體功能與狀態(tài)，并且不同的疾病可能具有共同的發(fā)病根源與癥狀，因此往往可以用同一中藥方劑進(jìn)行治療。通過分析冠心舒通膠囊的潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病等除冠心病外的其他疾病也在網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要位置。阿爾茨海默病是老年人癡呆的最常見原因，其病理特征是患者大腦中的淀粉樣蛋白-β斑塊沉積與細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維發(fā)生纏結(jié)，同時(shí)淀粉樣蛋白-β本身為一種較強(qiáng)的促炎因子，會(huì)促進(jìn)腦內(nèi)慢性炎癥的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡與神經(jīng)變性[27]。除此之外，有研究表明氧化應(yīng)激反應(yīng)也與阿爾茨海默病的進(jìn)展有關(guān)，腦內(nèi)活性氧含量增加會(huì)直接影響神經(jīng)元突觸的活性和神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[28]。冠心舒通膠囊中的廣棗、丹參等成分可通過抑制NF-κB等與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，改善機(jī)體微循環(huán)狀態(tài)，保護(hù)血管內(nèi)皮發(fā)揮其抗炎效應(yīng)。除此之外，廣棗中酚酸類成分，丹參中的丹參素、丹參酮等成分均具有良好的抗氧化活性[16-18]。并且已有報(bào)道證明丹參可通過抑制淀粉樣蛋白-β聚集并減少淀粉樣蛋白-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞毒素對(duì)阿爾茨海默病發(fā)揮治療作用[29]。冠心舒通膠囊對(duì)阿爾茨海默病的治療效用再一次印證傳統(tǒng)中藥具有“異病同治”的優(yōu)勢(shì)，并且為挖掘經(jīng)典方劑的其他臨床治療作用提供了新的思路。

紅色菱形代表候選化合物節(jié)點(diǎn)，其大小與節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的“度”數(shù)值有關(guān)。黃色三角形的“度”值為1，藍(lán)色圓形為2，綠色V形≥3。

紅色菱形代表潛在活性化合物，綠色圓形代表潛在靶點(diǎn)。其大小分別與它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中的“度”數(shù)值有關(guān)。

綠色圓形代表潛在靶點(diǎn)，紫色方形代表與之相關(guān)的疾病。其大小分別與它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中的“度”數(shù)值有關(guān)。

傳統(tǒng)中藥具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，能夠從系統(tǒng)層面對(duì)機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，作用機(jī)制十分復(fù)雜，對(duì)其的研究方法也應(yīng)與西藥有所不同。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合研究策略，發(fā)現(xiàn)冠心舒通膠囊中16種活性成分及其體內(nèi)靶點(diǎn)，揭示冠心舒通膠囊對(duì)冠心病的治療作用機(jī)制可能為抗炎、抗氧化與抗細(xì)胞凋亡。除對(duì)冠心病具有良好療效外，網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，冠心舒通膠囊還存在治療阿爾茨海默病等多種疾病的藥理作用。但其在體內(nèi)的具體作用方式仍需進(jìn)一步探究。