高源，李秀菊，趙雪，宗傳赪，王領(lǐng)

(武漢市第八醫(yī)院麻醉科，武漢 430010)

七氟醚是一種臨床常用吸入性全身麻醉藥物，具有誘導(dǎo)快、蘇醒迅速、理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，但臨床研究卻發(fā)現(xiàn)七氟醚可導(dǎo)致患者，尤其是老年患者出現(xiàn)術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)，其主要表現(xiàn)為麻醉術(shù)后出現(xiàn)記憶力減退、執(zhí)行力受損、定向力障礙以及抽象思維障礙等，對患者術(shù)后康復(fù)以及生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1-2]。七氟醚引起POCD發(fā)生的相關(guān)機(jī)制尚未明確，臨床上也缺乏有效的防治手段。醒脾解郁湯由石菖蒲、西洋參、熟地黃、郁金等常用于治療認(rèn)知障礙的中藥制成[3-4]，前期研究發(fā)現(xiàn)醒脾解郁湯對肝部分切除老年小鼠認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)元損傷具有較好的緩解作用[5]，提示醒脾解郁湯在認(rèn)知障礙相關(guān)疾病中具有較大的潛在價值。筆者在本實驗通過觀察醒脾解郁湯對七氟醚麻醉后老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為和細(xì)胞炎性因子水平的影響，探討醒脾解郁湯影響術(shù)后認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級C57BL/6J小鼠40只，18個月齡，雌雄各半，體質(zhì)量30～35 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0019；動物質(zhì)量合格證號：NO.42816300002591。動物實驗操作均嚴(yán)格遵循動物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定，所有小鼠于溫度22～26 ℃，相對濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2試藥 石菖蒲(批號：20161103)、西洋參(批號：20161101)、郁金(批號：20161102)和熟地黃(批號：20161101)購自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司。醒脾解郁湯組成[6]：取石菖蒲10 g，西洋參15 g，郁金12 g和熟地黃15 g放入容器中，加水并淹沒至藥材上1 cm處，浸泡30 min，先武火煮至沸騰，再文火煮30 min后倒出，即制成生藥含量為0.26 g·mL-1的醒脾解郁湯。七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：H20160706)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號分別為：A003-1、A001-1、A005、A013-2)。白細(xì)胞介素(IL)-17A、IL-2、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自貝茵萊公司(貨號分別為MU30386、MU30009、MU30044、MU30030)。兔抗caspase 3多克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體均購自Abcam公司(貨號分別為ab4051、ab182733、ab196495)；兔抗GAPDH多克隆抗體購自Proteintech公司(貨號：10494-1-AP)。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602)；電泳儀(Bio-Rad公司，型號：mini protean 3 cell)；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司，型號：Tanon-5200)。

1.4動物分組、給藥 將小鼠按照數(shù)字隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組，模型對照組，醒脾解郁湯小、中和大劑量組，每組8只。正常對照組小鼠吸入氧氣(30%)和氮氣(70%)的混合氣體6 h；模型對照組小鼠吸入2.6%七氟醚、30%氧氣和67.4%氮氣的混合氣體6 h；醒脾解郁湯小、中和大劑量組小鼠于七氟醚處理前6 d開始至處理后第2天，每天灌服醒脾解郁湯3.6，7.2，14.4 g·kg-1·d-1。

1.5水迷宮實驗 參照文獻(xiàn)[7]。訓(xùn)練期前檢測各組小鼠游泳速度以及逃逸潛伏期，各組間小鼠無明顯差異情況下進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。所有小鼠于吸入氣體前6 d開始進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，每日4次。每次將小鼠面向池壁入水，令其尋找置于第Ⅰ象限水面下1 cm處平臺，所耗時間記為逃逸潛伏期。本實驗設(shè)定最大時限為90 s(即在90 s內(nèi)未找到平臺者停止記錄，并將逃逸潛伏期記為90 s)。七氟醚處理后第2天撤去平臺，選取原平臺正對象限為動物入水點，讓動物自由游泳90 s，記錄90 s內(nèi)動物穿過平臺區(qū)的次數(shù)，并記錄逃逸潛伏期和在原平臺停留的時間。水迷宮測定完畢后，立即腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，麻醉小鼠后迅速處死，收集各組小鼠腦組織樣本，分離海馬及大腦皮層，保存于-80 ℃中備用。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 將收集的海馬及大腦皮層組織剪碎，按照1：5比例加入組織樣本和預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在冰上進(jìn)行勻漿，5000 r·min-1離心5 min(有效離心半徑為85 mm)，取上清液檢測SOD、MDA及GSH-PX表達(dá)變化，生化實驗檢測NO含量，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7炎癥因子檢測 取小鼠海馬及大腦皮質(zhì)組織，勻漿上清液，ELISA檢測各組小鼠海馬和大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的表達(dá)。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8Western blotting檢測 取各組小鼠海馬組織，采用RIPA裂解液提取組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣蛋白樣品30 μL，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，使用5%脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后分別加入一抗(Bax、Bcl-2和caspase-3)，4 ℃孵育過夜；TBST再次洗滌后，加入特異性二抗IgG，進(jìn)行室溫孵育1 h，洗膜，電致化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑對其曝光顯影，拍照保存。

2 結(jié)果

2.1小鼠記憶功能的影響 水迷宮訓(xùn)練前，各組小鼠游泳速度及逃逸潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。水迷宮測試結(jié)果見表2，與正常對照組比較，模型對照組小鼠逃逸潛伏期明顯延長，小鼠穿越平臺次數(shù)及在該象限停留的時間縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組逃逸潛伏期顯著縮短，小鼠穿越平臺的次數(shù)和在該象限停留時間延長，醒脾解郁湯大劑量組逃逸潛伏期時間最短，穿越平臺次數(shù)最多及在該象限停留的時間最長。

表1 5組小鼠訓(xùn)練前游泳速度及逃逸潛伏期比較

表2 5組老年小鼠記憶功能檢測值

2.2小鼠氧化應(yīng)激的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中SOD、GSH-PX和NO含量均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型對照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中SOD、GSH-PX和NO含量均顯著升高(均P<0.05)，MDA含量顯著降低(均P<0.05)。見表3，表4。

表3 5組小鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH-PX和NO的含量

表4 5組小鼠大腦皮層中SOD、MDA、GSH-PX和NO的含量

2.3小鼠炎癥因子的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05)。與模型對照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(均P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表5和表6。

表5 5組小鼠海馬組織中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

Tab.5 Contents of IL-17A，IL-2，IL-6 and TNF-α in hippocampus of five groups of mice

表5 5組小鼠海馬組織中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

組別IL-17AIL-2正常對照組101.68±10.39175.25±21.96模型對照組310.57±24.68①373.24±26.99①醒脾解郁湯 小劑量組263.44±11.10②316.07±12.60② 中劑量組237.89±13.86②281.31±20.96② 大劑量組191.01±9.52②③243.93±9.89②③F68.69459.381P<0.05<0.05組別IL-6 TNF-α正常對照組79.62±6.8980.03±7.22模型對照組166.65±7.48①248.97±30.76①醒脾解郁湯 小劑量組149.03±6.96②201.87±10.77② 中劑量組133.05±6.70②175.39±6.05② 大劑量組110.91±6.62②③151.64±6.04②③F81.51742.944P<0.05<0.05

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與醒脾解郁湯小劑量組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05； ②Compared with model control group，P<0.05； ③Compared with low-dose Xingpi Jieyu decoction group，P<0.05.

表6 5組小鼠大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

Tab.6 Contents of IL-17A，IL-2，IL-6 and TNF-α in cerebral cortex of five groups of mice

表6 5組小鼠大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

組別IL-17AIL-2正常對照組99.40±7.99185.50±22.56模型對照組314.90±21.05①371.70±30.83①醒脾解郁湯 小劑量組269.11±10.92②324.21±15.56② 中劑量組230.12±8.02②286.17±11.34② 大劑量組203.30±13.94②③235.65±15.48②③F80.44559.694P<0.05<0.05組別IL-6TNF-α正常對照組87.65±10.4974.03±8.30模型對照組167.43±6.63①232.55±16.48①醒脾解郁湯 小劑量組146.82±6.25②196.55±8.39② 中劑量組130.86±6.80②182.42±12.22② 大劑量組116.56±5.01②③150.94±8.83②③F86.53156.303P<0.05<0.05

①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與醒脾解郁湯小劑量組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05； ②Compared with model control group，P<0.05； ③Compared with low-dose Xingpi Jieyu decoction group，P<0.05.

2.4老年小鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blotting 結(jié)果見圖1。與正常對照組比較，模型對照組小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型對照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著降低(F=81.434，63.449，均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(F=80.352，P<0.05)，且呈劑量依賴性。

3 討論

在全身麻醉手術(shù)中，POCD是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，患者會出現(xiàn)記憶損害以及學(xué)習(xí)困難等主要臨床特征，POCD一般會持續(xù)>2周，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致不可逆的進(jìn)行性認(rèn)知功能減退[8-9]。已有研究證實，POCD發(fā)病的最重要危險因素之一是全身麻醉藥物的使用[1，10]。七氟醚作為臨床使用最頻繁的吸入性全身麻醉藥物，可顯著增加老年患者POCD的發(fā)病率，且七氟醚的暴露劑量與POCD患者認(rèn)知功能下降的程度具有相關(guān)性[11]。Morris水迷宮實驗是評估嚙齒類動物學(xué)習(xí)記憶能力的重要工具，受試動物根據(jù)迷宮周圍的參照物來確定平臺的位置，是一種以異我為參照的認(rèn)知過程[7]。本研究借助Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)七氟醚可顯著損害老年小鼠的記憶能力以及視空間學(xué)習(xí)能力，其主要表現(xiàn)為逃逸潛伏期延長、穿臺次數(shù)減少、平臺所在象限停留時間縮短，而醒脾解郁湯可有效改善七氟醚導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙，且呈劑量依賴性。

POCD的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為可能與麻醉手術(shù)導(dǎo)致的組織氧化應(yīng)激、炎癥因子過度釋放以及細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。七氟醚可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞變性及凋亡[13]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)七氟醚導(dǎo)致麻醉后認(rèn)知障礙的機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)[14]。氧自由基損傷可降低大腦學(xué)習(xí)記憶能力，自由基可激發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)分解終產(chǎn)物MDA通過交聯(lián)和結(jié)合形成脂褐素，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。而SOD、GSH-PX和NO則可以有效地清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)組織[15-16]。本研究結(jié)果顯示，醒脾解郁湯可顯著升高小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中SOD、GSH-PX和NO含量，降低MDA含量，且呈劑量依賴性。這表明醒脾解郁湯正是通過發(fā)揮其抗氧化作用有效緩解七氟醚所導(dǎo)致的氧自由基對小鼠認(rèn)知功能的損傷。細(xì)胞炎癥因子IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的過度釋放所引起的記憶長時程增強(qiáng)抑制被認(rèn)為是導(dǎo)致動物認(rèn)知功能損害的另一重要機(jī)制。細(xì)胞炎癥因子通?？烧T導(dǎo)谷氨酰胺神經(jīng)興奮毒性損傷、抑制海馬神經(jīng)元的發(fā)生、易化外周炎癥因子浸潤及擴(kuò)大神經(jīng)系統(tǒng)級聯(lián)炎癥反應(yīng)等[17]。因此，抑制細(xì)胞炎癥因子IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α等的過度釋放對于預(yù)防和緩解術(shù)后認(rèn)知功能障礙至關(guān)重要。王椿野等[6]研究結(jié)果顯示醒脾解郁方可通過抑制抑郁模型大鼠血清以及海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的過度釋放來改善其學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示醒脾解郁湯可顯著抑制小鼠海馬組織和大腦皮層中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的釋放，且呈劑量依賴性。這表明醒脾解郁湯通過抑制其炎癥因子的過度釋放有效緩解了七氟醚所導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能的損傷。研究表明，caspases家族在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，caspases是細(xì)胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，caspase 3是下游最關(guān)鍵的凋亡調(diào)控蛋白，機(jī)體在正常情況下，caspase 3處于非活化的狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時，通過caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)caspase切割并活化最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。Bax與Bcl-2均屬于Bcl-2家族，其分別具有促凋亡和抗凋亡作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示醒脾解郁湯可顯著抑制小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)，顯著升高Bcl-2蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性。這表明醒脾解郁湯正是通過調(diào)控小鼠大腦細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來有效緩解七氟醚所導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能的損傷。

1.正常對照組；2.模型對照組；3.醒脾解郁湯小劑量組；4.醒脾解郁湯中劑量組；5.醒脾解郁湯大劑量組。①與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與醒脾解郁湯小劑量組比較，P<0.05。

綜上所述，醒脾解郁湯可通過其抗氧化作用、抑制炎癥因子的過度釋放以及調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來有效緩解七氟醚所致的小鼠認(rèn)知功能損傷，且呈劑量依賴性，但其是否還通過其他信號通路發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步更深入研究。