魏 偉，朱國(guó)萍,2，章超樺,2，高加龍,2，曹文紅,2，鄭惠娜,2，秦小明,2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 國(guó)家貝類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東 湛江 524088）

學(xué)習(xí)記憶能力的基礎(chǔ)是神經(jīng)元的突觸可塑性。隨著全球老齡化的加劇，與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦健康問(wèn)題愈發(fā)凸顯，導(dǎo)致家庭與社會(huì)的負(fù)擔(dān)日益加重[1]。衰老過(guò)程中促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 等長(zhǎng)期刺激可導(dǎo)致慢性、低度、微炎性等炎性衰老狀態(tài)[2]。相關(guān)研究表明，衰老可觸發(fā)激活腦部的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子，炎性衰老狀態(tài)損傷神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，從而引起學(xué)習(xí)記憶能力衰退甚至導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[3-5]。Mcgeer等[6]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制慢性炎癥反應(yīng)可以改善由衰老引起的學(xué)習(xí)記憶能力衰退，進(jìn)而提升老年人的生活質(zhì)量。

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）是我國(guó)海水珍珠養(yǎng)殖的主要品種，主要分布于日本和我國(guó)南海沿岸，其營(yíng)養(yǎng)豐富，產(chǎn)量巨大，是一種尚待開(kāi)發(fā)的海洋資源[7]。據(jù)報(bào)道，馬氏珠母貝酶解產(chǎn)物具有抗衰老[8]、抗炎[9]、增強(qiáng)免疫[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]等多種生物活性。但是關(guān)于馬氏珠母貝酶解產(chǎn)物改善學(xué)習(xí)記憶能力的功效研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)分析馬氏珠母貝酶解蛋白粉營(yíng)養(yǎng)組成，以自然衰老斑馬魚(yú)作為動(dòng)物模型，飼喂馬氏珠母貝酶解蛋白粉，比較其T 迷宮行為學(xué)以及生物指標(biāo)的變化，探究馬氏珠母貝酶解蛋白粉對(duì)衰老斑馬魚(yú)（Daniorerio）空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，旨在為馬氏珠母貝酶解蛋白粉改善老年記憶功能衰退的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

馬氏珠母貝酶解蛋白粉（Enzymolysis protein powder ofPinctada martensii，EPP），廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院預(yù)制酶解蛋白粉。

6 月齡和18 月齡的斑馬魚(yú)，體長(zhǎng)分別為2.5～3.0 cm、2.8～ 3.3 cm，購(gòu)于上海乙諾水族科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；斑馬魚(yú)白細(xì)胞介素1β（IL-Iβ）試劑盒，（批號(hào)20190702-95471A）、斑馬魚(yú)腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒（批號(hào)20190702-95472A）、斑馬魚(yú)白細(xì)胞介素 10（IL-I0）試劑盒（批號(hào)：20190702-96083A）、斑馬魚(yú)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）試劑盒（批號(hào)：20190702-98030A），江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、硼酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖、石油醚等試劑均為分析純。

SZF-06A 脂肪測(cè)定儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；組織研磨儀，卡尤迪生物科技有限公司；SL1-700 恒溫孵育箱，上海愛(ài)朗儀器有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo 公司；ZEBRALAB 魚(yú)類(lèi)高通量實(shí)驗(yàn)監(jiān)控系統(tǒng)，法國(guó)Viewpoint life sciences 公司；T 型迷宮，法國(guó)Viewpoint life sciences 公司。

1.3 方法

1.3.1馬氏珠母貝酶解蛋白粉的制備 采用課題組預(yù)制馬氏珠母貝酶解蛋白粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酶解工藝條件參照課題組前期優(yōu)化條件[13]。

1.3.2馬氏珠母貝酶解蛋白粉基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定 水分測(cè)定采用常壓干燥法按GB 5009.3—2016測(cè)定；灰分測(cè)定采用高溫灼燒法按GB 5009.4—2016 測(cè)定；粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用凱氏定氮法按GB 5009.5—2016 測(cè)定；粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法按GB 5009.6—2016 測(cè)定；總糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法按GB/T 9695.31—2008 測(cè)定。

1.3.3馬氏珠母貝酶解蛋白粉氨基酸組成測(cè)定氨基酸組成采用氨基酸分析儀按GB5009.124—2016 測(cè)定。

1.3.4馬氏珠母貝酶解蛋白粉金屬含量測(cè)定 鈣、鐵、鋅、硒、銅、錳含量測(cè)定采用微波消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法按GB 5009.268—2016 測(cè)定。

1.3.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 所有的斑馬魚(yú)置于14 h 光照/10 h 黑暗的循環(huán)中（光照階段從7：00 am開(kāi)始），控制溫度（25±2）℃、空氣濕度（60±5）%，養(yǎng)殖用水是曝曬兩周后的自來(lái)水。不同年齡段的斑馬魚(yú)被盛于不同的長(zhǎng)方形水箱（35 cm×24 cm×20 cm）中，水箱配備過(guò)濾、溫控裝置，密度1.5 尾/L。

將40 尾18 月齡斑馬魚(yú)隨機(jī)分成兩組，每組20尾。另取20 尾6 月齡斑馬魚(yú)作為對(duì)照。分為對(duì)照組（6 月齡飼料喂養(yǎng)）、模型組（18 月齡飼料喂養(yǎng)）、實(shí)驗(yàn)組（18 月齡飼料按3.0 g/kg 劑量拌喂EPP）3組。適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周（14 d）后，進(jìn)行連續(xù)分組飼養(yǎng)30 d，每天一次。實(shí)驗(yàn)組EPP 飼喂量參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003 年版）》[14]按人體推薦劑量20 倍，3.0 g/kg 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6斑馬魚(yú)T 迷宮試驗(yàn) 參照葡韻竹[15]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。本試驗(yàn)所用 T 型迷宮由水平等長(zhǎng)的左右臂和垂直輔道組成。材料均為白色不透明的塑料板，以避免外界顏色對(duì)斑馬魚(yú)行為學(xué)產(chǎn)生影響。在測(cè)試期，T 迷宮與ZEBRALAB 魚(yú)類(lèi)高通量實(shí)驗(yàn)監(jiān)控系統(tǒng)聯(lián)合使用。該試驗(yàn)分適應(yīng)期與測(cè)試期兩個(gè)階段，為期5 d，試驗(yàn)期間不喂食。

行為學(xué)適應(yīng)期在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的31 d 上午9 點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行。將整組斑馬魚(yú)輕緩地放入T 迷宮中適應(yīng)2 h，并保證這段時(shí)間內(nèi)右臂一直有食物存在，以給予斑馬魚(yú)獎(jiǎng)賞刺激，形成記憶。適應(yīng)期未有數(shù)據(jù)。

行為學(xué)測(cè)試期從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的32 d 上午9 點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行。每組斑馬魚(yú)20 尾，逐尾進(jìn)行測(cè)試。在轉(zhuǎn)移斑馬魚(yú)的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)盡量動(dòng)作溫柔輕緩，以免對(duì)行為學(xué)結(jié)果產(chǎn)生影響。并且每尾待測(cè)魚(yú)在測(cè)試前需在安靜無(wú)干擾環(huán)境放置5 min 作預(yù)處理。在測(cè)試期間，斑馬魚(yú)在迷宮中的運(yùn)動(dòng)由帶有紅外檢測(cè)功能的攝像機(jī)監(jiān)控，攝像機(jī)位于迷宮正上方1.5 m處，并連接在一臺(tái)計(jì)算機(jī)上，便于實(shí)驗(yàn)人員觀察斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)。

測(cè)試時(shí)，將準(zhǔn)備好的斑馬魚(yú)放入垂直輔道起點(diǎn)處，并開(kāi)始5 min 計(jì)時(shí)。當(dāng)斑馬魚(yú)進(jìn)入右臂，并且持續(xù)時(shí)間大于或等于30 s 時(shí)，即認(rèn)為這尾斑馬魚(yú)成功進(jìn)入食物放置區(qū)，此時(shí)在右臂對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行食物獎(jiǎng)賞，斑馬魚(yú)從放入起點(diǎn)到進(jìn)入右臂的時(shí)間為潛伏期；若斑馬魚(yú)未成功進(jìn)入右臂，計(jì)時(shí)結(jié)束后引導(dǎo)其進(jìn)入右臂投喂食物，停留3 min，使斑馬魚(yú)將右臂與食物獎(jiǎng)勵(lì)形成聯(lián)系，其潛伏期計(jì)為300 s。每條魚(yú)測(cè)試結(jié)束后，系統(tǒng)自動(dòng)導(dǎo)出斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)軌跡，可用于計(jì)算右臂游動(dòng)路程占比。

測(cè)試結(jié)束后，將斑馬魚(yú)放到提前備好的魚(yú)缸中，進(jìn)行下一條魚(yú)的測(cè)試。當(dāng)整組魚(yú)測(cè)試結(jié)束后，一起放回原來(lái)的水箱。

行為學(xué)測(cè)試每天一次，持續(xù)4 d。在剔除不游動(dòng)的斑馬魚(yú)后，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)進(jìn)入食物放置區(qū)（右臂）的成功率、潛伏時(shí)間、右臂游動(dòng)路程占比。

1.3.7腦組織樣本的制備 將完成行為學(xué)試驗(yàn)的斑馬魚(yú)于次日上午在冰水混合物中低溫麻醉后稱(chēng)重，按順序放置于冰面上，用眼科鑷打開(kāi)被固定斑馬魚(yú)的頭蓋后，完整將全腦取出，將魚(yú)腦分析天平稱(chēng)重并記錄，盛裝于預(yù)先備好的離心管，為保證樣品量3 個(gè)斑馬魚(yú)腦組織作為一個(gè)樣品（n=6，其余兩個(gè)魚(yú)腦組織用作試劑盒濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)），在液氮中急凍后，放于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

將凍存的魚(yú)腦解凍后，按照質(zhì)量體積比1∶9加入磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）后，進(jìn)行組織勻漿，勻漿液在3 000 r·min-1，4 ℃條件下離心10 min，取上清，轉(zhuǎn)移至新離心管后，凍存于-80 ℃冰箱，備后續(xù)生物化學(xué)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.8斑馬魚(yú)腦組織炎癥因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子測(cè)定 采用斑馬魚(yú)IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF 試劑盒測(cè)定魚(yú)腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF含量，具體操作嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)。采用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品蛋白含量，具體操作嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)除行為學(xué)結(jié)果外均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行為學(xué)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異顯著性分析，行為學(xué)成功率采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。顯著水平α=0.05。采用JMP Pro 13 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin Pro 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPP 基本營(yíng)養(yǎng)組成分析

EPP 基本營(yíng)養(yǎng)組成見(jiàn)表1，EPP 粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)78.28%，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.96%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.88%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.87%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.59%。同水解牡蠣(Crassostrea rivularis)粉（粗蛋白52.40%、粗脂肪1.09%、總糖12.00%、水分14.20%、灰分17.20%）[16]相比，具有高蛋白特點(diǎn)。

表1 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的基本營(yíng)養(yǎng)組成Table 1 Contents of basic component in EPP %

2.2 EPP 氨基酸組成分析

對(duì)EPP 氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示EPP 氨基酸種類(lèi)齊全，含量豐富。尤其是天冬氨酸、谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以蛋白粉為基礎(chǔ)）很高，分別達(dá)到8.87、13.00%，兩者占總氨基酸比例28.21%，均高于牡蠣酶解產(chǎn)物含量[17]。EPP 的主要氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、精氨酸。EPP的疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.39%，疏水性氨基酸占總氨基酸比例為36.62%，高于牡蠣酶解產(chǎn)物組分（31.04%）[18]。

表2 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of EPP %

2.3 EPP 金屬元素含量分析

EPP 金屬含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，所測(cè)定的金屬元素（以蛋白粉為基礎(chǔ)）中Ca 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)725.54 mg/kg，占全部測(cè)定元素的86.32%。EPP 除Ca 含量很高外，還含有較高的Fe 和Zn 元素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.80、48.71 mg/kg，以上3 種元素占全部測(cè)定元素的98.75%。另外EPP 還含有較低量的錳、銅、硒元素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.16、3.14、2.19 mg/kg。

表3 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的金屬元素含量Table 3 Metal element content of EPP mg/kg

2.4 EPP 對(duì)斑馬魚(yú)體質(zhì)量的影響

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育期，體質(zhì)量的增長(zhǎng)情況是反映動(dòng)物健康狀況最基本的指標(biāo)之一[19]。因此可通過(guò)測(cè)量比較實(shí)驗(yàn)后斑馬魚(yú)的質(zhì)量對(duì)EPP 進(jìn)行初步食用安全性評(píng)價(jià)。

各組斑馬魚(yú)體質(zhì)量見(jiàn)圖1，經(jīng)比較，各組斑馬魚(yú)體質(zhì)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各組斑馬魚(yú)體質(zhì)量分別為：對(duì)照組（0.52±0.09）g、模型組（0.54±0.13）g、實(shí)驗(yàn)組（0.59±0.12）g。這初步表明，EPP 對(duì)斑馬魚(yú)的正常生長(zhǎng)無(wú)影響，是一種安全的海洋食品原料。

圖1 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對(duì)斑馬魚(yú)體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of EPP on the body weight in zebrafish

2.5 EPP 對(duì)斑馬魚(yú)行為學(xué)的影響

T 迷宮試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2?？傮w而言，從行為學(xué)測(cè)試開(kāi)始，對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)的覓食成功率、潛伏期、右臂游動(dòng)路程占比在3、4 d 均趨于穩(wěn)定和一致，這可能是因?yàn)樾袨閷W(xué)測(cè)試過(guò)程中對(duì)斑馬魚(yú)記憶的鞏固強(qiáng)化所致，因此在接下來(lái)分析中中僅描述和討論1～ 2 d 的行為學(xué)結(jié)果。與對(duì)照組相比，模型組1～ 2 d 成功率未有顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組1、2 d 成功率均顯著升高（P＜0.05）（圖a）。與對(duì)照組相比，模型組潛伏期1、2 d 略高（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組潛伏期明顯降低（P＞0.05）（圖b）。與對(duì)照組相比，模型組右臂游動(dòng)路程占比1、2 d 未有顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組占比1、2 d 均顯著升高（P＜0.05）（圖c）。行為學(xué)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)于模型組。綜上所述，EPP可以有效改善自然衰老斑馬魚(yú)的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖2 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對(duì)斑馬魚(yú)行為學(xué)的影響Fig.2 The effects of EPP on zebrafish behavioristics

2.6 EPP 對(duì)斑馬魚(yú)腦組織炎癥因子含量的影響

EPP 對(duì)斑馬魚(yú)腦組織炎癥因子含量的影響見(jiàn)表4，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦組織IL-1β、TNF-α 含量顯著上升（P＜0.05），表明衰老導(dǎo)致了斑馬魚(yú)腦部炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腦組織IL-1β、TNF-α 含量顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明EPP 能夠抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具有顯著的體內(nèi)抗炎作用，表明EPP 對(duì)衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能與其抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)。另外，各組斑馬魚(yú)腦組織中IL-10 含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05），但可見(jiàn)模型組斑馬魚(yú)腦組織IL-10 含量較高。

表4 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對(duì)斑馬魚(yú)腦組織炎癥因子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 4 Effects of EPP on the content of inflammatory factors in zebrafish brain tissue pg/mg

2.7 EPP 對(duì)斑馬魚(yú)腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量的影響

EPP對(duì)斑馬魚(yú)腦組織BDNF含量的影響見(jiàn)圖3，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦組織中BDNF 的含量無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腦組織中BDNF 含量顯著升高（P＜0.05）。各組斑馬魚(yú)腦組織BDNF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)別為：對(duì)照組（389.18±37.38）、模型組（392.39±26.89）、實(shí)驗(yàn)組（447.38±48.32）pg/mg。這表明，EPP 可以提高自然衰老斑馬魚(yú)腦組織中的BDNF 含量。

圖3 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對(duì)斑馬魚(yú)腦組織BDNF含量的影響Fig.3 Effect of EPP on the content of BDNF in zebrafish brain tissue

3 討論

學(xué)習(xí)記憶能力會(huì)受到衰老的顯著影響，是最先衰退的認(rèn)知功能之一[20]。衰老伴隨的自由基氧化會(huì)通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)炎癥小體的形成、誘導(dǎo)MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）磷酸化、活化NF-κB（調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子分泌的核轉(zhuǎn)錄因子），導(dǎo)致大腦慢性炎癥，進(jìn)而損傷宿主的學(xué)習(xí)記憶能力[21-23]。本研究結(jié)果表明，EPP 中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)78.28%，經(jīng)酶解后，含有大量的低分子肽。氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，EPP 含有豐富的酸性氨基酸（Glu、Asp）和疏水性氨基酸，分別占總氨基酸的28.21%、36.62%。酸性氨基酸可作為氫供體中和自由基的氧化性；疏水性氨基酸可提高小分子肽在體內(nèi)水-脂界面的溶解度，提升抗氧化能力，EPP 可能通過(guò)抗氧化途徑抑制炎癥反應(yīng)、提高學(xué)習(xí)記憶能力[24]。另外，金屬元素含量測(cè)定結(jié)果表明，EPP 含有豐富的Ca、Fe、Zn 元素。金屬元素在人體中主要以酶輔基或直接參與的形式影響包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的所有生命活動(dòng)，孫艷等[25]研究發(fā)現(xiàn)Zn 預(yù)處理可以降低LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，補(bǔ)充Zn 可能對(duì)學(xué)習(xí)記憶有改善作用。從EPP 的營(yíng)養(yǎng)組成來(lái)看，其可能具有通過(guò)抗氧化途徑或直接作用改善大腦炎癥狀況，提升學(xué)習(xí)記憶能力的功效。

衰老會(huì)導(dǎo)致包括斑馬魚(yú)在內(nèi)的脊椎動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降，且衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的衰退可通過(guò)行為學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估[26-27]。T 迷宮是從嚙齒類(lèi)動(dòng)物向斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶研究工具轉(zhuǎn)化的經(jīng)典范例，其在簡(jiǎn)單的設(shè)備和較少的學(xué)習(xí)成本條件下即可評(píng)估斑馬魚(yú)的學(xué)習(xí)記憶能力[28]。在迷宮試驗(yàn)中，予以斑馬魚(yú)食物獎(jiǎng)勵(lì)刺激是常用的刺激方式之一[29]。本研究采用T 迷宮行為學(xué)方法，分析斑馬魚(yú)的覓食成功率、潛伏期、右臂游動(dòng)路程占比以評(píng)估斑馬魚(yú)的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)覓食成功率偏低而潛伏期偏高，呈現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的損傷趨勢(shì)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)在行為學(xué)測(cè)試期1～ 2 d 的覓食成功率（P＜0.05）、右臂游動(dòng)路程占比（P＜0.05）、潛伏期表現(xiàn)全面提升，表明EPP 可以明顯改善自然衰老斑馬魚(yú)的學(xué)習(xí)記憶能力。

學(xué)習(xí)與記憶的基礎(chǔ)是突觸可塑性，包括新突觸的形成、神經(jīng)元重塑、新神經(jīng)元的生成[30]。突觸可塑性衰退的中心活動(dòng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫激活，即神經(jīng)炎癥[31]。小膠質(zhì)細(xì)胞是一種存在于腦組織的主要免疫細(xì)胞，衰老條件下會(huì)發(fā)生活化，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以極化為兩種不同的表型：M1 型和M2型[32]。M1 型極化是一種有害表型，其特征在于促炎因子（IL-1β、TNF-α 等）的高表達(dá)，反映腦組織炎癥狀況。IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，可直接抑制LTP（引起突觸可塑性改變的主要形式），造成記憶能力下降[33]，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和存活產(chǎn)生不利影響[34]；IL-1β、TNF-α 也可能通過(guò)降低BDNF表達(dá)量，損傷學(xué)習(xí)記憶能力[30,35]。M2 型極化是一種有益表型，其特征在于BDNF 和抑炎因子（IL-10等）的表達(dá)[32]，BDNF 是一種廣泛存在于大腦的蛋白質(zhì)，與神經(jīng)再生、空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)，可以通過(guò)誘發(fā)LTP、促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和存活而影響記憶的形成，與神經(jīng)元的突觸可塑性呈正相關(guān)[33,36]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖，降低其它促炎細(xì)胞因子水平。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦組織中IL-1β、TNF-α含量均顯著上升（P＜0.05）、BDNF 含量無(wú)明顯差異；在EPP 飼喂后，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)腦組織中的IL-1β、TNF-α 含量均顯著下降（P＜0.05）、BDNF 含量顯著升高（P＜0.05）。表明EPP對(duì)神經(jīng)炎癥有抑制作用，其可通過(guò)緩解神經(jīng)炎癥、提高BDNF 含量來(lái)改善衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力。斑馬魚(yú)腦組織IL-10 含量各組之間的差異并不顯著（P＞0.05），但模型組斑馬魚(yú)腦組織中IL-10、BDNF含量的相對(duì)增加，表示斑馬魚(yú)大腦可能因衰老而觸發(fā)的適應(yīng)性機(jī)制，自身會(huì)通過(guò)適當(dāng)?shù)目寡追磻?yīng)來(lái)補(bǔ)償炎癥水平的加劇。Song 等[37]的研究也表現(xiàn)出斑馬魚(yú)在逆環(huán)境中的IL-10 和BDNF 上升。值得注意的是，雖然與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)腦組織中的IL-1β、TNF-α 含量顯著升高，但是與對(duì)照組相比，模型組斑馬魚(yú)并未表現(xiàn)出更差的行為學(xué)結(jié)果，這可能是由于6 月齡和18 月齡斑馬魚(yú)對(duì)環(huán)境變化的不同敏感程度造成的。Remy 等[38]對(duì)環(huán)境富集條件下青年和衰老斑馬魚(yú)的行為學(xué)進(jìn)行研究，所得結(jié)果與本研究一致。

EPP 改善自然衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的功效可能是基于酶解產(chǎn)生的肽類(lèi)物質(zhì)或者包括金屬元素在內(nèi)的其它組分，也可能是所有成分共同作用的結(jié)果。其改善學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)還需進(jìn)一步探究，另外，本研究雖在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上采用EPP 3.0 g/(kg·d) 的飼喂劑量，發(fā)現(xiàn)EPP 具有改善自然衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的功效，但是其具體的量效關(guān)系仍然未知。因此，在本研究基礎(chǔ)上，對(duì)不同劑量的EPP 分離組分改善衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的探討將作為下一步工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

EPP 是一種高蛋白、氨基酸種類(lèi)齊全，富含金屬元素的優(yōu)質(zhì)海洋食品原料。飼喂EPP 30 d 后，自然衰老斑馬魚(yú)進(jìn)入T 迷宮右臂的成功率、潛伏期及右臂游動(dòng)路程占比均有明顯改善，腦組織中IL-1β、TNF-α 含量顯著降低，BDNF 含量升高。表明EPP 具有改善自然衰老斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的功效，其機(jī)制可能與EPP 緩解斑馬魚(yú)腦組織炎癥狀況、提高腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平有關(guān)。