聶 磊，謝子強，彭 丹

（1.深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，廣東 深圳 518268；2.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518120）

人類現(xiàn)代社會活動高強度排放大量溫室氣體，導(dǎo)致大氣CO2濃度不斷升高，進(jìn)而引發(fā)諸如海平面升高、水循環(huán)異常、全球變暖、海洋酸化等系列重大環(huán)境問題，且相關(guān)問題自工業(yè)革命以來不斷加劇。據(jù)報道，全球海洋pH 值至21 世紀(jì)末期可能降至7.4，大氣CO2濃度可能加大到現(xiàn)在的5 倍[1]。珊瑚藻（coralline algae）屬于紅藻門（Rhodophyta）紅藻綱（Rhodophyceae）真紅藻亞綱（Florideophycidae）珊瑚藻目（Corallinales），是一類海洋常見大型紅藻，物種多樣性豐富，體內(nèi)含有大量碳酸鈣。珊瑚藻主要有殼狀、枝狀和瘤塊狀三種形態(tài)，葉狀體堅硬，又分有節(jié)和無節(jié)兩大類。珊瑚藻是海洋生物礁系統(tǒng)中最為重要的功能類群之一，在生物礁生態(tài)系統(tǒng)和礁體建造中具有廣泛和核心作用。開展珊瑚藻研究和保護(hù)，對生物礁生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)保護(hù)、以珊瑚為主的海洋受損生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)等具有重大影響[2]。珊瑚藻具有鈣質(zhì)無機骨架，在生物礁鈣質(zhì)體的建造與維護(hù)方面不可替代，同時又被認(rèn)為是對海洋酸化最敏感的藻類生物之一，但目前國內(nèi)外關(guān)于海水酸化態(tài)勢下珊瑚藻的生理機制研究仍較少見，至于殼狀珊瑚藻（crustose coralline algae，CCA）的國內(nèi)生理生態(tài)研究更是空白[3]。本研究以南海海域典型的殼狀珊瑚藻擬中葉藻和枝狀珊瑚藻叉節(jié)藻為對象，比較分析海水酸化對于殼狀及枝狀珊瑚藻的生長、光合色素積累、碳酸酐酶（CA）以及鈣化固碳的影響差異，以期為探索珊瑚藻，尤其殼狀珊瑚藻的生態(tài)機理以及珊瑚礁的生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)提供理論支持。

1 材料與方法

實驗采用的叉節(jié)藻（Amphiroa ephedraea）和擬中葉藻（Mesophyllum simulans）樣品于2018 年8 月采集于深圳大鵬灣潮間帶(114°36′N，22°25′E),新鮮采集的叉節(jié)藻，蒸餾水洗去泥沙及其他附著物，去除雜藻，選擇生長旺盛，藻體完整的樣本滅菌處理3～4 次。以500 mL 錐形瓶作為培養(yǎng)容器，保持每瓶添加的叉節(jié)藻藻體質(zhì)量為（5.0±0.05）g。殼狀藻擬中葉藻連同原有生長基石一起在錐形瓶中培養(yǎng)[4]。

1.1 不同培養(yǎng)條件的設(shè)置

實驗設(shè)置3 個不同pH 值的培養(yǎng)條件：8.2、7.8和7.4，各設(shè)3 個平行組。pH 值使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)液校正的pH 計（FE20，Mettler Toledo，Switzerland）測定。pH 值8.2 的處理為深圳大鵬灣自然海水，通過向自然海水充入瓶裝CO2氣體獲得7.8 和7.4 的 pH值，充氣時用pH 計即時監(jiān)測海水pH 值變化，當(dāng)pH 達(dá)到所需值時停止充氣，放入藻體進(jìn)行靜水培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱控制培養(yǎng)溫度為20 ℃，光照強度為100 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h∶12 h，每天搖動藻體 2 次。培養(yǎng)過程監(jiān)測 pH 值，90 d 后測定不同處理下珊瑚藻的各項生長和生理生化指標(biāo)。

1.2 生長分析

培養(yǎng)開始前和結(jié)束時用蒸餾水清洗藻體，其中擬中葉藻藻結(jié)皮用刀片輕輕刮下。用吸水紙吸干藻體表面，分別測定藻體的鮮質(zhì)量，按公式（1）計算出相對生長率（RGR）[4]：

其中，m0為實驗開始時海藻的鮮質(zhì)量，mt為實驗t天后海藻的鮮質(zhì)量。t為實驗中藻類培養(yǎng)時間，單位為d。

1.3 光合色素分析

采用分光光度法測定珊瑚藻葉綠素a（Chl a）、類胡蘿卜素（Car）和藻紅蛋白（PE）質(zhì)量濃度，取 0.1 g 左右的新鮮藻體經(jīng)丙酮研磨后浸提，4 000 r/min 離心10 min，取上清液分別在波長 480 nm、645 nm和 663 nm 下測定提取液的光密度，然后再按照下列公式將濃度換算為樣品葉綠素 a 質(zhì)量濃度（單位：mg·L-1）和類胡蘿卜素質(zhì)量濃度(單位：μg·L-1)，D代表上清液在相應(yīng)波長下光密度[5]：

藻紅蛋白（PE）質(zhì)量濃度的測定：取 0.1 g 新鮮藻體在磷酸緩沖液（pH=6.8）研磨后浸提，經(jīng)4 000 r/min 離心10 min，取上清液分別在波長455、564 和592 nm 波長處測定光密度D[5]。PE 質(zhì)量濃度按公式（4）計算，單位為mg·L-1：

1.4 碳酸酐酶（CA）活性分析

稱取藻樣品0.5 g 置于預(yù)冷研缽中，在冰浴條件下加入3 mL 提取液（5 mmol/L 巰基乙醇，15 mmol/L 巴比妥緩沖液，pH=8.2）進(jìn)行研磨，用4層消毒紗布對研磨勻漿過濾，濾液在4 ℃環(huán)境中用離心機7 000 r/min 下離心5 min，取上清液（CA粗提液），4 ℃下冷藏待進(jìn)行CA 活性測定，以煮沸5 min 冷卻的部分上清液作為對照。采用pH 計法測定碳酸酐酶活性，分別在兩個冰浴條件下的小燒杯中依次加入15 mmol/L 巴比妥緩沖液、未煮沸或者煮沸的碳酸酐酶粗提液以及冰冷的CO2飽和水，記錄下pH 值由8.2 下降至7.4 所用的時間。研磨過濾后的固體殘渣及離心后的沉淀物用于葉綠素a 濃度的測定。CA 活性的計算公式如下[6]：

其中υCA代表碳酸酐酶活性，tc代表對照中pH 值從8.2 下降至7.4 所用的時間（min），ts代表未煮沸酶液pH 值從8.2 下降至7.4 所用的時間（min），MChla代表測定藻體的葉綠素量（μg）。

1.5 藻體中碳成分的含量測定

珊瑚藻樣品經(jīng)烘箱烘干（于50 ℃條件下）后研磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取1.0 mg 樣品用玻璃微纖維濾紙包裹，置于不密封的玻璃試管中，試管在濃鹽酸揮發(fā)形成的酸霧條件下暴露酸熏24 h，除去樣品中的顆粒無機碳（PIC），第二次烘干待測定，樣品有機碳含量由碳氮分析儀（multi N/C UV，Analytik Jena AG，Germany）測定。經(jīng)過酸熏處理的粉末樣品測定結(jié)果為珊瑚藻藻體顆粒有機碳（POC）含量，未經(jīng)酸熏處理的樣品測定結(jié)果為總的碳顆粒含量，減去POC 的量即為藻體顆粒無機碳（PIC）含量。

1.6 鈣化固碳速率和光合固碳速率的測定

不同培養(yǎng)條件下的珊瑚藻分別測定其在3 h 的時間間隔內(nèi)PIC 和POC 含量變化，以PIC 含量的增加速率表示藻的鈣化固碳速率（Cn），POC 含量的增加速率表示光合固碳速率（Pn）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 分析后,根據(jù)單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗數(shù)據(jù)差異顯著性，顯著性水平α設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水酸化對于珊瑚藻光合固碳速率、光合色素含量及碳酸酐酶活力的影響

珊瑚藻的光合作用是以CO2和為底物，把無機碳合成有機物的過程，可以用方程式表示為：CO2+H2O ? CH2O+O2；這是對CO2的一個吸收過程。在本研究中，通過向培養(yǎng)水體中充入高濃度CO2的方法降低海水pH 值，珊瑚藻的光合固碳速率（Pn）隨著pH 值的下降而逐步上升，其中pH7.4 條件下藻體的光合固碳能力要高于pH 7.8（圖1）。經(jīng)90 d 培養(yǎng)后，pH7.4 培養(yǎng)條件下的叉節(jié)藻光合固碳速率達(dá)到[（6.21±0.47）mg·g-1·h-1]，較pH 7.8 條件下增加了6.15%，達(dá)到了pH 8.2 條件下的26.52%。殼狀珊瑚藻在pH 值降低狀況下的光合能力上升幅度絕對值不如枝狀珊瑚藻，但相對差異值則更為明顯。經(jīng)90 d 培養(yǎng)后，擬中葉藻在pH 7.8到 pH 7.4 之間的光合固碳效率上升幅度達(dá)到13.46 %（達(dá)到顯著水平），超過叉葉藻的上升幅度。

圖1 海水酸化處理對珊瑚藻光合固碳速率的影響Fig.1 The effects of seawater acidification on the rate of photosynthetic carbon fixation of coralline algae

不同pH 海水處理90 d 后測定珊瑚藻中的葉綠素a 質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖2。與pH 8.2 的對照組比較可發(fā)現(xiàn)，海水酸化處理下實驗組的葉綠素a 與藻紅蛋白（PE）質(zhì)量濃度明顯降低，且隨著pH 值減低而不斷下降，在pH 7.8 和pH 7.4 處理下，叉節(jié)藻分別下降了29.52%和48.30%，而擬中葉藻葉綠素a 分別下降了22.72%和50.15%，均達(dá)到了顯著水平，藻紅蛋白質(zhì)量濃度的變化趨勢與此類似。在pH 7.8 和pH 7.4 的海水酸化處理下，叉節(jié)藻的類胡蘿卜素含量分別上升了21.52%、和23.47%，而和擬中葉藻則上升了24.33%和33.35%，珊瑚藻的類胡蘿卜素質(zhì)量濃度在海水酸化處理下的變化趨勢與葉綠素a 與藻紅蛋白（PE）相反。

圖2 海水酸化處理對珊瑚藻光合色素含量的影響Fig.2 The effects of seawater acidification on the contents of photosynthetic pigments of coralline algae

作為與Rubisco 羧化酶（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）同樣屬于光合作用過程中催化（同化）無機碳的關(guān)鍵（限速）性酶，碳酸酐酶（CA）主要分布在珊瑚藻細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)體、葉綠體中或者細(xì)胞質(zhì)膜表面，主要生理功能為可逆性催化CO2（碳酸酐）水合反應(yīng)的迅速進(jìn)行，反應(yīng)式為：CO2+H2O ?+H+[6]。由圖3 可見，海水酸化處理下珊瑚藻的碳酸酐酶活性明顯下降。在pH 7.8 和pH 7.4 處理下，叉節(jié)藻的碳酸酐酶活性分別下降了 23.10%和40.43%，和擬中葉藻則下降36.3%和59.61%，經(jīng)統(tǒng)計分析均達(dá)到了顯著水平。

圖3 海水酸化處理對珊瑚藻碳酸酐酶活性的影響Fig.3 The effects of seawater acidification on the activities of CA of coralline algae

2.2 海水酸化對于珊瑚藻鈣化固碳速率及相對生長速率的影響

珊瑚藻能夠通過鈣化作用(Calcification)，將海水中的碳酸氫根轉(zhuǎn)化為氣態(tài)CO2,具體方程式為:海水酸化處理明顯降低了珊瑚藻鈣化固碳速率，在海水pH值7.4 的酸性環(huán)境條件下，叉節(jié)藻經(jīng)過90 d 處理后鈣化能力表現(xiàn)為負(fù)值[（-0.52±0.07）mg·g-1·h-1]，較對照絕對值下降了110.42%，殼狀珊瑚藻也在酸化環(huán)境下明顯降低了鈣化能力，在海水pH 7.8 酸化處理的75 d，擬中葉藻的鈣化固碳速率就下降為了負(fù)值[（-0.08±0.01）mg·g-1·h-1] (圖4)。pH 7.8 和pH 7.4 的海水處理90 d 后，擬中葉藻的鈣化固碳速率絕對值分別下降了77.78%和128.89%。

圖4 海水酸化處理對珊瑚藻鈣化固碳速率的影響Fig.4 The effects of seawater acidification on the rate of calcified carbon fixation of coralline algae

藻體鈣化量（PIC）與有機物（POC）的比例同時受到珊瑚藻光合固碳能力與鈣化固碳能力影響。由于海水酸化條件下，珊瑚藻的光合能力明顯提升，鈣化能力卻顯著下降，因此PIC/POC 比值有明顯的降低，pH 7.8 和pH 7.4 酸化海水處理下，叉節(jié)藻和擬中葉藻的PIC/POC 比值均在0.2 以下（圖5）。

圖5 海水酸化處理對珊瑚藻PIC/POC 比值的影響Fig.5 The effects of seawater acidification on the ratio of PIC/POC of coralline algae

隨著海水酸化處理的pH 值逐漸降低,盡管光合固碳能力有所升高，但枝狀珊瑚藻的鈣化能力卻急劇下降，因此相對增長率（RGR）越來越小，在pH7.4 海水處理下，叉節(jié)藻相對增長率較對照明顯下降了38.24%（P＜ 0.05），而殼狀的擬中葉藻可能由于生長緩慢，在90 d 的培養(yǎng)期內(nèi)相對增長率的下降程度并未達(dá)到顯著水平(圖6)。

圖6 海水酸化處理對珊瑚藻生長的影響Fig.6 The effects of seawater acidification on the growth of coralline algae

3 討論

海洋是地球碳循環(huán)體系里的核心部分，隨著全球變化的進(jìn)程，海水里的CO2體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，加劇海洋酸化。海水pH 值不斷降低，極大地改變了海洋碳酸鹽系統(tǒng)面貌，對于在全球碳循環(huán)中扮演舉足輕重角色的海洋鈣化生物，包括鈣化海藻也將產(chǎn)生重要影響[8]。作為全球海洋底棲世界的最重要成分，珊瑚藻的生理生態(tài)特性在國內(nèi)外已有一些科學(xué)探索，包括光合生理、碳酸鹽骨架礦物學(xué)以及生態(tài)服務(wù)功能等，但仍有大量理論空白等待研究，人類尤其在殼狀珊瑚藻領(lǐng)域了解不多[9]。國內(nèi)外對于環(huán)境因素對珊瑚藻的生理影響研究很少，當(dāng)前僅少量報道研究了光照、海水酸化等因素對枝狀珊瑚藻的生理影響，至于殼狀珊瑚藻生理生化分析方面的專門研究則更為少見[3,10]。

深圳海域位于我國南亞熱帶海區(qū)，尤其東部的大鵬海域水溫、鹽度比較穩(wěn)定，而且水體清澈、透光性好，適宜珊瑚藻棲息生長[11]。本區(qū)珊瑚藻群落可以分為近岸與離岸兩種類型，近岸型的種類以對于濁度、沉積速率和懸浮物耐受能力較強的種類為主，并且對光照強度較敏感。本實驗以本地區(qū)近岸型的典型枝狀珊瑚藻種類叉節(jié)藻和殼狀珊瑚藻種類擬中葉藻為研究對象，開展海水酸化相關(guān)研究。

3.1 海水酸化對珊瑚藻的光合作用影響分析

在以往的大型海藻研究中，都已發(fā)現(xiàn)高濃度CO2能促進(jìn)光合作用[12]。本實驗通過向培養(yǎng)水體中充入高濃度的CO2，使pH 值降低(如降至pH=6.8)，引起培養(yǎng)海水中CO2和的濃度增加，為光合作用的暗反應(yīng)過程提供了更充足的底物，同樣導(dǎo)致了小珊瑚藻光合作用的升高。其中，pH7.4 條件下藻體的光合固碳效率要高于pH 7.8。殼狀珊瑚藻在pH 值降低狀況下的光合能力上升變化幅度更為明顯（P＜ 0.01）。

在光合色素方面，實驗發(fā)現(xiàn)高濃度CO2使得珊瑚藻體中葉綠素a 和藻紅蛋白的含量下降，類胡蘿卜素含量升高，這與之前在細(xì)基江蘺（Gracilaria tenuistipitata）等藻類研究結(jié)果相似[13]。保護(hù)色素含類胡蘿卜素量的增加，應(yīng)該是海水酸化刺激下藻體應(yīng)對的保護(hù)措施；藻紅蛋白起著吸收光能與傳遞能量的重要作用，從實驗結(jié)果看，海水酸化處理對珊瑚藻藻紅蛋白有明顯的破壞作用。

3.2 海水酸化對珊瑚藻的鈣化作用影響分析

珊瑚藻通過光合和鈣化兩種方式固定二氧化碳，因為無法直接利用空氣中的無機碳，珊瑚藻在漫長的進(jìn)化歷程中形成了一套無機碳濃縮機制，亦被稱為“CO2/泵”[14]。碳酸酐酶（CA）在其中扮演了將氣態(tài)CO2分子轉(zhuǎn)換為可溶性的核心角色，再以特殊轉(zhuǎn)運機制，最終為珊瑚藻的光合暗反應(yīng)提供無機碳底物。在各種大型海藻中，紅藻門的海藻對利用能力較弱，遠(yuǎn)不如褐藻和綠藻[15]。因此碳酸酐酶（CA）通過CO2濃縮機制提供足夠的濃度，對于保障珊瑚藻等紅藻類的光合能力有著重要意義。對于鈣化藻類的無柄珊瑚藻（Corallina sessilis）相關(guān)研究結(jié)果顯示，海水CO2濃度升高會導(dǎo)致碳酸酐酶活性下降[16]，主要原因可能在于濃度的不斷提高導(dǎo)致了CA 的活性受到抑制，而本研究在枝狀珊瑚藻和殼狀珊瑚藻的實驗結(jié)果也與此類似。

珊瑚藻的生命過程中涵括了鈣化作用和有機碳生產(chǎn)兩個過程，藻體通過有機碳泵(生物泵)從事有機碳的初級生產(chǎn)，通過碳酸鹽反向泵（溶解泵）完成胞壁沉積CaCO3的鈣化作用，最終，全球廣泛分布的珊瑚藻通過這兩個剛好相反同時又相輔相成的化學(xué)過程實現(xiàn)對大氣CO2濃度的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響全球的氣候變化[17]。珊瑚藻屬于對CO2濃度升高引起海水酸化過程高度敏感的重點生物種之一，其鈣化作用容易受到空氣和海水中 CO2濃度變化的雙重影響。學(xué)術(shù)界普遍的認(rèn)識是，當(dāng)空氣CO2體積分?jǐn)?shù)升高時，海水中H+濃度對數(shù)值將相應(yīng)減小，導(dǎo)致CaCO3飽和度逐漸降低，珊瑚藻鈣化因此會受到抑制[18]。徐智廣等[19]研究發(fā)現(xiàn)海水pH 值5.5 的酸性環(huán)境條件下，小珊瑚藻鈣化表現(xiàn)為負(fù)值[（-2.53±0.57）mg·g-1·h-1]，這可能是過多的H+使得小珊瑚藻的鈣化組織部分溶解所造成。本研究同樣發(fā)現(xiàn)海水酸化處理明顯降低珊瑚藻鈣化固碳速率，海水pH 值7.4 的酸性環(huán)境條件下，叉節(jié)藻和擬中葉藻在實驗處理后鈣化均表現(xiàn)為負(fù)值。在海水pH 7.8 酸化處理的75 d，擬中葉藻的鈣化固碳速率就已下降為負(fù)值[（-0.08±0.01）mg·g-1·h-1] 。海水酸化條件下，珊瑚藻的光合能力明顯提升，鈣化能力卻顯著下降，因此PIC/POC 比值相應(yīng)有明顯降低。pH 7.8 和pH 7.4 酸化海水處理下，叉節(jié)藻和擬中葉藻的PIC/POC 比值均在0.2以下。

3.3 海水酸化對珊瑚藻的生長影響分析

已有的相關(guān)研究顯示[16,20]，珊瑚藻的生長及生理活性對于海水酸化以及伴隨而來的海水溫度升高有負(fù)面的反應(yīng)，海水CO2濃度升高可抑制珊瑚藻的鈣化與生長，破壞藻體的生理結(jié)構(gòu)。在本實驗中，枝狀珊瑚藻隨著海水酸化處理的pH 值下降出，光合固碳能力有所升高，但鈣化能力卻急劇下降，因此相對增長率（RGR）越來越小，在pH 7.4 海水處理下，叉節(jié)藻相對增長率較對照明顯下降了38.24%（P＜ 0.05），而殼狀的擬中葉藻由于生長緩慢的原因，在90 d 培養(yǎng)期內(nèi)相對增長率的下降程度并未達(dá)到顯著水平。

海水酸化對于殼狀及枝狀珊瑚藻的生長、光合色素積累、碳酸酐酶活性以及鈣化固碳能力的影響存在明顯差異。殼狀珊瑚藻在海水酸化下的鈣化生理指標(biāo)和生長數(shù)值變化幅度不算明顯，但相對差異更為顯著。實驗中殼狀珊瑚藻擬中葉藻可能由于本身生長緩慢，且由于本實驗設(shè)計周期的持續(xù)時間有限，暫未發(fā)現(xiàn)海水酸化對于藻體生長的負(fù)面影響達(dá)到顯著水平，尚有待今后更長周期的培養(yǎng)和實驗。

綜上，一定pH 值范圍內(nèi)的海水酸化處理，對于珊瑚藻的光合作用有所促進(jìn)，同時明顯降低鈣化量和碳酸酐酶活性，改變光合色素含量與PIC/POC比值，進(jìn)而抑制枝狀藻體生長。鑒于珊瑚藻在海洋生態(tài)系統(tǒng)中所承擔(dān)的重要角色，在未來研究中，非常值得對珊瑚藻，尤其是殼狀珊瑚藻的鈣化過程開展更加廣泛和深入的研究，為海洋生物對于海水酸化響應(yīng)研究，以及全球變化下生物圈碳循環(huán)與碳匯的研究提供相應(yīng)依據(jù)[2-3,21]。