鄭丹丹，韓凱，石嗣中，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 晉中 030801)

山西老陳醋以其獨特的釀造工藝和酸爽醇厚的風味位于我國四大名醋之首，不僅是人們?nèi)粘Ｉ钪酗L味優(yōu)良的調(diào)味佳品，而且具有祛濕防病、軟化血管、美容健體等功效。其“蒸、酵、熏、淋、曬”釀造工藝已被列入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，熏醅是其釀造工藝的精華之一[1-2]，醋醅在熱的作用下由原先的淺棕色變?yōu)樽睾稚饕怯捎诿览路磻?yīng)后期產(chǎn)生了大量類黑精。類黑精是一種良好的天然抗氧化劑，除了賦予老陳醋特殊色澤及風味的同時，還具有抗腫瘤、抗炎、抑菌、降糖、降脂、降壓等功能特性，但對其活性機理尚不明確，還有待進一步研究。目前，在調(diào)味品等食品行業(yè)中，由于市售調(diào)味品中抗氧化劑大多是合成的且具有一定危害性，因而類黑精作為天然抗氧化劑的研究及應(yīng)用在調(diào)味品等食品行業(yè)具有很廣闊的前景[3]。高效的提取分離方法是對類黑精深入研究的前提。

超聲-微波協(xié)同提取法是近年來將微波的電磁能和超聲波的機械振蕩效果相結(jié)合的一種新興輔助提取技術(shù)，具有提取率高、提取時間短、能耗低等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于天然活性物質(zhì)的提取[4-5]，由于光波的迅速致熱比只用微波有更高的加熱溫度，更有助于類黑精的提取，且未見超聲-微波-光波組合對熏醅中類黑精提取的文獻報道。本研究采用超聲-微波-光波協(xié)同提取熏醅中類黑精，并通過響應(yīng)面法確定最佳提取條件，以期為山西老陳醋熏醅中類黑精的深入研究提供理論依據(jù)，并為類黑精的開發(fā)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西老陳醋熏醅：參照GB/T 19777-2013《地理標志產(chǎn)品 山西老陳醋》中的釀造工藝制成；蒸餾水(均為國產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

FA224電子天平、722型可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；超聲波清洗機、SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；CG-8220多功能研磨機 中山市長柏電器實業(yè)有限公司；KDC-140HR高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；79-1型磁力加熱攪拌器、THZ-82恒溫振蕩水浴鍋 常州潤華電器有限公司；G70F20CN1L-DG(B0)格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山西老陳醋熏醅中類黑精的提取

山西老陳醋熏醅→粉碎(至粒徑為0.2～0.4 mm)→超聲-微波-光波協(xié)同提取→離心(25 ℃，10000 r/min，20 min)→濃縮濾液→醇沉(4倍體積無水乙醇)→靜置(4 ℃，24 h)→離心(25 ℃，10000 r/min，10 min)→冷凍干燥→山西老陳醋熏醅中類黑精提取物。

1.3.2 類黑精提取量的測定方法

采用分光光度法測定，按式(1)計算。

類黑精提取量=A420×V。

(1)

A420值與類黑精含量呈正相關(guān)[6-7]。式中：A420為類黑精提取液在420 nm處的吸光值；V為相對體積比倍數(shù)或料液比倍數(shù)。

1.4 單因素試驗設(shè)計

按照1.3.2所述方法提取山西老陳醋熏醅中類黑精，探究液料比、超聲溫度、超聲時間、微波-光波組合方式、微波-光波時間對熏醅中類黑精提取量的影響。準確稱取熏醅5.00 g，液料比分別為10，20，30，40，50，60，70 (mL/g)；超聲溫度分別為20，30，40，50，60，70，80 ℃；超聲時間分別為0，10，20，30，40，50，60 min；微波-光波組合方式分別為100%光波、30%微波+70%光波、55%微波+45%光波、100%微波；微波-光波時間分別為0，1，2，3，4，5，6，7 min。固定單因素條件液料比為40 (mL/g)，超聲溫度為60 ℃，超聲時間為30 min，微波-光波組合方式為55%微波+45%光波，微波-光波時間為4 min。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，運用Box-Benhnken設(shè)計原理進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，以類黑精提取量(AV值)為響應(yīng)值，固定微波-光波組合方式為55%微波+45%光波，以液料比、超聲溫度、超聲時間、微波-光波時間為自變量，分別考察各自變量對響應(yīng)值的影響并對提取條件進行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計

1.6 提取率與提取級數(shù)測定

在確定類黑精最佳提取條件下，多次浸提5.00 g熏醅，直至最后類黑精提取液吸光度小于0.02，分別收集各次提取液吸光度Ai并測體積Vi；最后合并各次提取液，得到總體積V與總吸光度A，計算各次提取率，確定提取級數(shù)，類黑精提取率按式(2)計算。

類黑精提取率=AiVi/AV×100%。

(2)

1.7 不同提取方法比較

準確稱取4份熏醅5.00 g，其提取工藝同1.3.2，并按照以下提取條件對4種提取方法進行比較，每個試驗重復3次。

水浴提?。阂毫媳?4 (mL/g)、水浴溫度67 ℃、水浴時間1.0 h。

超聲波輔助提?。阂毫媳?4 (mL/g)、超聲溫度67 ℃、超聲時間28 min。

微波-光波輔助提?。阂毫媳?4 (mL/g)、微波-光波總功率700 W、微波-光波組合方式為55%微波+44%光波、微波-光波時間6 min。

超聲-微波-光波協(xié)同提?。毫弦罕?4 (mL/g)、超聲溫度67 ℃、超聲時間28 min、微波-光波總功率700 W、微波-光波組合方式為55%微波+44%光波、微波-光波時間6 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

由圖1可知，隨著液料比的增加，熏醅中類黑精提取量呈先升高后下降的趨勢，當液料比為30 (mL/g)時，熏醅中類黑精提取量達到最高，之后繼續(xù)增大液料比，類黑精提取量反而下降，這是因為提取劑用量是類黑精提取中很好的推動力，適宜濃度差可起到良好的提取效果[8]。在一定范圍內(nèi)增加提取劑用量可影響固相主體與液相主體間的濃度差，有助于提高溶劑擴散率和傳質(zhì)速率，但當提取劑量過高時，相同時間提供的熱量被提取劑吸收的比例增加，空化效應(yīng)和機械效應(yīng)等強度減弱，影響類黑精提取效率，并且浸出的類黑精對未浸出產(chǎn)物有一定抑制作用，提取完全所需時間也相應(yīng)延長[9]。綜合考慮后續(xù)的濃縮操作和耗能成本等因素，選擇液料比(mL/g)為20，30，40 作為后續(xù)響應(yīng)面分析的3個水平。

圖1 液料比對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

2.2 超聲溫度對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

由圖2可知，類黑精提取量隨著超聲溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，當超聲溫度為70 ℃時類黑精提取量達到最大，這是因為隨著超聲溫度適當升高，分子運動速度加快，從而使熏醅滲透擴散速度加快，有利于熏醅中類黑精溶出，但超聲溫度過高時，會導致部分類黑精結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而易分解，同時增加了溶液中雜質(zhì)的溶出量，使類黑精提取量降低。由此選擇超聲溫度為60，70，80 ℃作為后續(xù)響應(yīng)面分析的3個水平。

圖2 超聲溫度對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

2.3 超聲時間對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

由圖3可知，超聲時間在0～60 min內(nèi)，熏醅中類黑精提取量呈先上升后下降的趨勢，當超聲時間為30 min時類黑精提取量出現(xiàn)峰值。隨著超聲時間的增加，由于超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)及機械作用，使熏醅中類黑精充分與提取劑接觸，類黑精提取量隨之增大，但超聲時間過長，提取劑易揮發(fā)，導致部分類黑精結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而易分解，或使其他非類黑精聚合物溶出，使類黑精提取量下降[10]。因此，選擇超聲時間20，30，40 min作為后續(xù)響應(yīng)面分析的3個水平。

圖3 超聲時間對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

2.4 微波-光波組合方式對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

由圖4可知，4種微波-光波組合方式(微波-光波總功率為700 W)對熏醅中類黑精提取量的影響由強到弱依次為：55%微波+45%光波>100%微波>30%微波+70%光波>100%光波，這是因為光波加熱是由外向內(nèi)靠熱輻射對物質(zhì)進行加熱；而微波加熱是由內(nèi)向外靠穿透物質(zhì)，使其內(nèi)部分子產(chǎn)生振動和摩擦，進而對物質(zhì)加熱，且加熱極其迅速。然而微波-光波組合處理時，光波迅速致熱比只用微波有更高的加熱溫度，配合微波的內(nèi)加熱與分子攪拌功能，進而加快了熏醅中類黑精溶出[11-12]。因此，后續(xù)響應(yīng)面設(shè)計微波-光波組合方式為55%微波+45%光波最佳。

圖4 微波-光波組合方式對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

2.5 微波-光波時間對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

由圖5可知，隨著微波-光波時間逐漸增加，熏醅中類黑精提取量呈先升高后下降的趨勢，當微波-光波時間為6 min時，類黑精提取量達到最大。但當微波-光波時間延長到7 min時，類黑精提取量略有下降，但差異不顯著(P>0.05)，這可能因為隨著微波-光波時間的逐漸增加，微波和光波對熏醅組織不斷破壞，使熏醅中類黑精不斷溶出，但增加到一定時間后，類黑精提取量達到最大，再持續(xù)加熱易引起溶液局部溫度過高，破壞類黑精結(jié)構(gòu)并使其分解，進而使類黑精提取量逐漸下降[13-14]。綜合考慮能耗成本等因素，選擇微波-光波時間為4，5，6 min 作為后續(xù)響應(yīng)面分析的3個水平。

圖5 微波-光波時間對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的影響

2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可知，山西老陳醋熏醅中類黑精提取量對液料比(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)和微波-光波時間(D)的二次多項回歸模型為:

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

山西老陳醋熏醅中類黑精提取量(AV值)=268.68+7.54A-14.75B-2.30C+33.92D-4.41AB-4.47AC+4.03AD-4.13BC-1.58BD-4.00CD-18.54A2-32.78B2-14.68C2-12.46D2。

由表3可知，P<0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項P=0.4529>0.05，表明失擬不顯著，選用的回歸模型是適當?shù)?；決定系數(shù)R2=0.9933，則試驗結(jié)果與模型預測結(jié)果具有良好一致性；校正系數(shù)RAdj2=0.9866，說明試驗結(jié)果有98.66%受試驗因素影響。因此，響應(yīng)面試驗結(jié)果可靠，此模型可對試驗結(jié)果進行分析和預測。

表3 回歸模型及方差分析

回歸模型中F值可判斷出各因素對響應(yīng)值的影響，各因素對熏醅中類黑精提取量影響的大小順序為：D>B>A>C，即微波-光波時間對熏醅中類黑精提取量的影響程度最大。一次項中A，B，D的影響是極顯著的(P<0.01)，C的影響是顯著的(P<0.05)；二次項中A2、B2、C2、D2的影響均達到極顯著水平(P<0.01)；交互項中AB、AC、AD、BC、CD的影響是顯著的(P<0.05)，而BD的影響是不顯著的(P>0.05)，這表明各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.7 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸模型繪出的3D曲面圖和等高線圖，可直接觀察出各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系及兩兩因素間的交互作用，3D曲面圖越陡，等高線越接近橢圓，說明兩因素間的交互作用越顯著[15]。由圖6可知，AB、AC、AD、BC、CD的交互作用顯著(P<0.05)，BD間的交互作用不顯著(P>0.05)，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對山西老陳醋熏醅中類黑精提取量的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

2.8 確定最佳提取條件與驗證回歸模型

結(jié)合回歸模型分析，超聲-微波-光波協(xié)同提取山西老陳醋熏醅中類黑精的最佳工藝條件為：液料比33.924(mL/g)、超聲溫度67.217 ℃、超聲時間28.407 min、微波-光波組合方式為55%微波+45%光波、微波-光波時間5.915 min，此提取條件下熏醅中類黑精提取量預測值為293.959。考慮到實際操作的可行性，將以上提取條件修正為：液料比34 (mL/g)、超聲溫度67 ℃、超聲時間28 min、微波-光波組合方式為55%微波+45%光波、微波-光波時間6 min。在此提取條件下進行3次平行試驗，得到熏醅中類黑精提取量為290.856±1.738，與預測值相差1.06%，結(jié)果表明，該回歸方程模型優(yōu)化得到的熏醅中類黑精提取工藝參數(shù)準確可靠，具有一定實際應(yīng)用價值。

2.9 最佳提取級數(shù)的確定

在類黑精最佳提取條件下，多次浸提熏醅試樣，按1.6的方法計算不同級數(shù)的類黑精提取率。

由表4可知，隨著提取級數(shù)的增加，熏醅中類黑精提取量逐漸增大，經(jīng)2次提取后類黑精提取率已達92.03%，提取較為完全，因而山西老陳醋熏醅中類黑精最佳提取級數(shù)為2級。

表4 提取級數(shù)對提取效果的影響

2.10 不同提取方法的比較

由表5可知，超聲-微波-光波協(xié)同提取熏醅中類黑精顯著高于其他3種方法(P<0.05)，超聲-微波-光波協(xié)同提取與單一的水浴提取、超聲波輔助提取和微波-光波輔助提取相比，類黑精提取量分別提高了201.64%、158.81%和83.67%。與其他3種方法相比，超聲-微波-光波協(xié)同提取可在短時間內(nèi)利用微波熱效應(yīng)和超聲波空化作用，再加上光波的迅速致熱，加快了熏醅中類黑精的溶出，具有一定的推廣應(yīng)用價值。

表5 4種提取方法的比較

3 結(jié)論

本試驗采用響應(yīng)面法對山西老陳醋熏醅中類黑精提取工藝進行優(yōu)化，最終確定了超聲-微波-光波協(xié)同提取法的最佳提取條件為：液料比34 (mL/g)，超聲溫度67 ℃，超聲時間28 min，微波-光波組合方式為55%微波+45%光波，微波-光波時間6 min，提取級數(shù)2級，在此最佳提取條件下，熏醅中類黑精提取量(AV值)為290.856±1.738，與預測值相差1.06%，與單一的水浴提取、超聲波輔助提取和微波-光波輔助提取相比，類黑精提取量分別提高了201.64%、158.81%和83.67%。超聲-微波-光波協(xié)同提取法不僅操作簡便、結(jié)果可靠，還具有高效、節(jié)能、無污染等優(yōu)點，具有一定的理論意義及應(yīng)用價值。熏醅中類黑精賦予了山西老陳醋色澤、香氣及功能成分，但其活性機理尚不明確，試驗采用超聲-微波-光波協(xié)同提取法高效提取類黑精，為山西老陳醋熏醅中類黑精的深入研究提供了技術(shù)依據(jù)，同時在調(diào)味品等食品行業(yè)，對類黑精作為天然抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用具有一定實踐意義。