楊智勇 王曉英 陳永革 周莎莎 魏亞超 李晶 郭志遠(yuǎn) 祁衛(wèi)華

腎細(xì)胞癌是起源于腎實(shí)質(zhì)的泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例超過40萬，發(fā)病率約占惡性腫瘤的2%[1]。腎透明細(xì)胞癌是腎細(xì)胞癌的主要病理類型，占發(fā)病總數(shù)的80%以上。由于其早期無癥狀且缺乏特異性診斷標(biāo)志物，30%的患者確診時(shí)已處于腫瘤中晚期[2-3]。目前，手術(shù)切除輔助放化療是臨床治療腎透明細(xì)胞癌的首選方案，但化療藥物不良反應(yīng)廣泛且易產(chǎn)生耐藥性，是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因之一[4]。

中醫(yī)藥基于辯證論治方法，具有整體調(diào)理、標(biāo)本兼治、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤治療方面逐漸得到關(guān)注與認(rèn)可。葛根素是中藥葛根的主要活性成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)非小細(xì)胞肺癌[6]、結(jié)腸癌[7]、乳腺癌[8]等具有一定治療作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用[7-8]。本研究通過觀察葛根素對(duì)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞增殖與凋亡的影響，探討其抑制786-O細(xì)胞生長的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要藥物與試劑 葛根素購自上海源葉生物科技有限公司（純度≥99%，批號(hào)：B21028）；5-氟尿嘧啶購自美國 Selleck公司（純度≥99.97%，批號(hào)：S1209）；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司（批號(hào)：1951038）；胰蛋白酶消化液、鏈青霉素雙抗、FBS購自上海源葉生物科技有限公司（批號(hào)：20191213、20190930、20200128）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ELC）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號(hào)：CA1210、SW2030）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司（批號(hào)：201911016、202001005、201912011）；細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、磷酸化 PI3K（phosphorylated PI3K,p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、周期蛋白激酶抑制因子p27、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體和山羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：bsm-52369R、bs-10276R、bs-5570R、bs-6951R、bs-0876R、bs-0623R、bs-0742R、bs-0081R、bs-0294P）。

1.3 主要儀器 BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱為德國Heraeus公司產(chǎn)品；iMark型酶標(biāo)儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；CyFlow Counter型流式細(xì)胞儀為德國Partec公司產(chǎn)品；SE300型電泳儀、TE22型轉(zhuǎn)膜儀為美國Hoefer公司產(chǎn)品；5427R型低溫高速離心機(jī)為德國Eppendrof公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥 人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株復(fù)蘇后接種于含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于5%二氧化碳、飽和濕度、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每2 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞覆蓋率約80%時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長期786-O細(xì)胞分別給予DMSO（空白對(duì)照組）、終濃度10、20、40 mg/L的葛根素溶液[9]（分別為葛根素10、20、40 mg/L組）和 70 mg/L的5-氟尿嘧啶溶液[10]（5-氟尿嘧啶組）干預(yù)。

1.4.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率 各組細(xì)胞分別給藥干預(yù)6、12、24、48 h，經(jīng)0.25%胰酶消化和重懸后制備濃度1×104個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，100μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，10μl/孔加入濃度10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收集細(xì)胞，通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值（A）。細(xì)胞增殖率（%）=（A藥物組/A空白對(duì)照組）×100%

1.4.3 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 各組細(xì)胞分別給藥干預(yù)48 h后更換不含藥的常規(guī)培養(yǎng)基，每3 d更換1次培養(yǎng)基，14 d后棄培養(yǎng)基，PBS溶液浸洗細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定15 min，1 ml/孔加入0.5%結(jié)晶紫染液染色30 min，吸去染液并晾干后，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 各組細(xì)胞分別給藥干預(yù)48 h后用0.25%胰蛋白酶消化，離心取細(xì)胞，75%乙醇溶液固定12 h，經(jīng)PBS溶液洗滌后滴加PI溶液避光孵育30 min，通過流式細(xì)胞儀檢測488 nm處PI熒光，分析G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分比。

1.4.5 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞分別給藥干預(yù)48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化，經(jīng)PBS溶液洗滌后按照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明進(jìn)行處理，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡水平。

1.4.6 Western blot法檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞分別給藥干預(yù)48 h后用0.25%胰酶消化，離心取細(xì)胞、冰上裂解30 min后4℃、12 000 r/min離心15 min取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，95℃水浴10 min使蛋白變性，行SDS-PAGE電泳分離蛋白、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜、麗春紅溶液染色、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，洗膜后滴加目標(biāo)蛋白抗體、β-actin抗體4℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過條帶灰度值計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞增殖率比較 隨著葛根素10、20、40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預(yù)時(shí)間的延長，786-O細(xì)胞增殖率逐漸降低。干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組相比，葛根素10、20、40 mg/L組與5-氟尿嘧啶組786-O細(xì)胞增殖率明顯降低（均P＜0.01），且葛根素40 mg/L組786-O細(xì)胞增殖率明顯低于5-氟尿嘧啶組（P＜0.01）。見圖 1。

圖1 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞增殖率比較（a為干預(yù)6、12、24、48 h細(xì)胞增殖率變化；b為干預(yù)48 h細(xì)胞增殖率比較；與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△△P＜0.01）

2.2 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞克隆形成能力比較干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組相比，葛根素20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細(xì)胞克隆數(shù)目明顯降低（均P＜0.01），且葛根素40 mg/L組786-O細(xì)胞克隆數(shù)目明顯低于 5-氟尿嘧啶組（P＜0.01）。見圖 2（插頁）、3。

圖2 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞克隆顯微鏡下所見（a為空白對(duì)照組；b為葛根素10 mg/L組；c為葛根素20 mg/L組；d為葛根素40 mg/L組；e為5-氟尿嘧啶組；結(jié)晶紫染液染色，×100倍）

圖3 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞克隆形成能力比較（與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△△P＜0.01）

2.3 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞周期分布比較 干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組相比，葛根素20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組G0/G1期細(xì)胞百分比升高，S期細(xì)胞百分比降低（均P＜0.01），G2/M期細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與5-氟尿嘧啶組相比，葛根素40 mg/L組G0/G1期細(xì)胞百分比明顯升高且S期細(xì)胞百分比明顯降低（P＜0.05或0.01），G2/M期細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞周期分布比較（與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與 5- 氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

2.4 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞凋亡率比較 干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組相比，葛根素 10、20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細(xì)胞凋亡率均升高（均P＜0.01），其中葛根素40 mg/L組786-O細(xì)胞凋亡率明顯低于5-氟尿嘧啶組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞凋亡率比較（與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與 5- 氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05）

2.5 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平比較 干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組相比，葛根素10、20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細(xì)胞PTEN表達(dá)水平上調(diào)，p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)（均 P＜0.05或 0.01），PI3K、Akt磷酸化比率降低（均P＜0.05或0.01）；且與5-氟尿嘧啶組相比，葛根素40 mg/L組PTEN表達(dá)水平上調(diào)，p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平下調(diào)（均 P＜0.05或 0.01），PI3K、Akt磷酸化比率降低（均P＜0.05）。見圖6-8。

圖6 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)電泳圖（PTEN為第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶；PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；Akt為蛋白激酶B；p-Akt為磷酸化蛋白激酶B；a為空白對(duì)照組；b為葛根素10 mg/L組；c為葛根素20 mg/L組；d為葛根素40 mg/L組；e為5-氟尿嘧啶組）

圖7 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平比較（PTEN為第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶；PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；Akt為蛋白激酶B；p-Akt為磷酸化蛋白激酶B；與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 5- 氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

圖8 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞PI3K、Akt蛋白磷酸化比率比較（a為PI3K蛋白磷酸化比率比較；b為Akt蛋白磷酸化比率比較；與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05）

2.6 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 干預(yù)48 h后，與空白對(duì)照組相比，葛根素10、20、40 mg/L組和5-氟尿嘧啶組786-O細(xì)胞cyclin D1表達(dá)水平下調(diào)，p27、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平上調(diào)（均P＜0.01）；與5-氟尿嘧啶組相比，葛根素40 mg/L組Cleaved Caspase-3、p27表達(dá)水平明顯上調(diào)且cyclin D1表達(dá)水平明顯下調(diào)（均 P＜0.05或 0.01）。見圖 9、10。

圖9 各組腎透明細(xì)胞癌 786-O細(xì)胞 cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖（cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1；p27為周期蛋白激酶抑制因子p27；Cleaved Caspase-3為激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；a為空白對(duì)照組；b為葛根素10 mg/L組；c為葛根素20 mg/L組；d為葛根素40 mg/L組；e為5-氟尿嘧啶組）

圖10 各組腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞 cyclin D1、p27、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1；p27為周期蛋白激酶抑制因子p27；Cleaved Caspase-3為激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與5-氟尿嘧啶組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

3 討論

細(xì)胞增殖失控與凋亡受阻是腫瘤細(xì)胞異常生長的重要因素，所以抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要途徑。近年來，隨著振興中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，中藥抗腫瘤得到普遍關(guān)注，應(yīng)用逐漸廣泛。葛根是以豆科植物野葛的干燥根入藥，是一味長期應(yīng)用于臨床的中藥，收入《中國藥典》。葛根素是中藥葛根的主要活性成分，目前臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病的治療，近年來葛根素抗腫瘤活性得到廣泛關(guān)注。本研究以人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞為受試細(xì)胞，并以臨床治療腎透明細(xì)胞癌一線化療藥物5-氟尿嘧啶作為陽性對(duì)照藥物開展研究，結(jié)果顯示經(jīng)葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預(yù)能夠顯著降低786-O細(xì)胞增殖率和細(xì)胞克隆數(shù)目，提高786-O細(xì)胞凋亡率，并且葛根素40 mg/L組效果優(yōu)于5-氟尿嘧啶組，說明葛根素具有抑制人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用。

細(xì)胞周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，一個(gè)完整的細(xì)胞周期分為G0/G1期、S期、G2/M期三個(gè)階段。徐楗熒等[11]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制G1期-S期轉(zhuǎn)換能夠阻止細(xì)胞有絲分裂而阻滯細(xì)胞周期，可作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)。有多種蛋白參與細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)過程，其中cyclin D1主要在G1期表達(dá)，能夠通過刺激腺病毒E2啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)與釋放，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)G1期到S期運(yùn)轉(zhuǎn)。Zheng等[12]研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1過度表達(dá)能夠縮短細(xì)胞周期，是導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控引發(fā)癌變的重要因素。周期蛋白激酶抑制因子p27能夠與cyclin D1結(jié)合而抑制其活性，對(duì)細(xì)胞周期表現(xiàn)為負(fù)性調(diào)控作用[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預(yù)能夠明顯下調(diào)786-O細(xì)胞cyclin D1表達(dá)并上調(diào)p27表達(dá)，并且葛根素40 mg/L組效果優(yōu)于5-氟尿嘧啶組，這可能是葛根素抑制786-O細(xì)胞增殖的重要分子機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是由多種信號(hào)通路和蛋白參與調(diào)控的復(fù)雜過程，Cleaved Caspase-3參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)及全過程的調(diào)控，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[14]。腫瘤細(xì)胞異常快速增殖過程中導(dǎo)致局部缺氧，病理性刺激線粒體膜通道異常開放導(dǎo)致細(xì)胞色素C過度釋放，細(xì)胞色素C能夠誘導(dǎo)Caspase-3轉(zhuǎn)化為Cleaved Caspase-3而被激活[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預(yù)能夠顯著上調(diào)786-O細(xì)胞Cleaved Caspase-3表達(dá)，并且葛根素40 mg/L組效果優(yōu)于5-氟尿嘧啶70 mg/L組，這可能是葛根素促進(jìn)786-O細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。

Akt為PI3K的下游基因，p-PI3K能夠誘導(dǎo)Akt磷酸化（p-Akt）而被活化，PI3K/Akt通路在細(xì)胞增殖與凋亡過程中具有重要調(diào)控作用[16]。PTEN是一種抑癌基因，能夠抑制PI3K磷酸化而抑制其活化，所以PTEN具有抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的作用[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)p-Akt具有誘導(dǎo)Caspase-3活化并上調(diào)Cyclin D1表達(dá)、下調(diào)p27表達(dá)的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)葛根素20～40 mg/L或5-氟尿嘧啶干預(yù)能夠顯著上調(diào)786-O細(xì)胞PTEN表達(dá)并下調(diào)p-PI3K、p-Akt表達(dá)，降低PI3K、Akt磷酸化比率，并且葛根素40 mg/L組效果優(yōu)于5-氟尿嘧啶70 mg/L組，提示葛根素具有上調(diào)PTEN表達(dá)而抑制PI3K/Akt通路的作用。

綜上所述，葛根素能夠通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞生長，可能與誘導(dǎo)PTEN表達(dá)而抑制PI3K/Akt通路有關(guān)。