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        非洲豬瘟病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

        2021-06-10 01:10:38謝春芳于瑞嵩董世娟陳冰清
        國外畜牧學(xué)·豬與禽 2021年2期

        謝春芳 于瑞嵩 董世娟 陳冰清

        摘? 要:非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)自發(fā)現(xiàn)以來,從非洲大陸傳播到歐洲、亞洲,中間短暫消失但不久又卷土重來,一直頑固地存在著,這是否與ASFV獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)系,值得我們進(jìn)一步探索研究。ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白有50多個(gè),其核心大DNA基因組由核殼、內(nèi)膜、衣殼和外包膜層層包裹,可以抵御外界環(huán)境的侵襲和傷害。了解ASFV的結(jié)構(gòu)形態(tài)及組裝機(jī)制,有助于深入解析ASFV的降解切入點(diǎn),從而控制ASFV的復(fù)制,瓦解成熟的病毒粒子,讓ASFV徹底從豬群、傳播媒介中消失。

        關(guān)鍵詞:非洲豬瘟病毒;大DNA病毒;形態(tài)結(jié)構(gòu)

        中圖分類號:S855 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:C 文章編號:1001-0769(2021)02-0037-05

        非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)是一種雙鏈大DNA病毒,目前是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)唯一的成員。非洲豬瘟病毒粒子直徑為250 nm~? ?300 nm,基因組長度為170 kb~194 kb;細(xì)胞內(nèi)ASFV粒子直徑約200 nm,病毒基因組與核蛋白聚集成病毒核心,核心外包裹有蛋白核殼,核殼外包裹著脂質(zhì)內(nèi)膜,脂質(zhì)內(nèi)膜外是二十面體蛋白衣殼,最后通過出胞獲得病毒外膜,成為一個(gè)成熟完整的ASFV粒子[1-5](圖1)。

        ASFV在環(huán)境中非常穩(wěn)定,在4 ℃血液中可保存一年以上,在肉制品中可保存數(shù)周。ASFV可在蜱類和豬中高效復(fù)制,并在兩者之間循環(huán)傳播[6]。

        ASFV通過脫殼侵入細(xì)胞,病毒脫殼需要酸性環(huán)境破壞病毒的外膜和蛋白衣殼。在細(xì)胞的內(nèi)泡小體內(nèi),病毒的外膜和二十面體蛋白衣殼被破壞,暴露出病毒內(nèi)膜,病毒內(nèi)膜與細(xì)胞膜融合,病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),感染宿主細(xì)胞。ASFV感染細(xì)胞后,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近的“病毒工廠(Viral Factories,VFs)”中進(jìn)行復(fù)制[7]。

        在早期核內(nèi)復(fù)制階段,ASFV會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核膜破裂并募集細(xì)胞S期特異性翻譯因子——真核翻譯起始因子4E/4G(eukaryotic translation Initiation Factor 4E/4G,eIF4E/4G)和真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding Protein 1,4E-BP1)到病毒工廠,以增強(qiáng)病毒復(fù)制能力,然后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行病毒DNA復(fù)制和包裝[8-10]。

        1? 病毒核心

        ASFV粒子基因組和核蛋白形成病毒核心部分,ASFV pA104R是組蛋白樣蛋白,屬于核蛋白,對染色體的扭曲、彎曲、折疊等拓?fù)湫揎棸l(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能,以增加核穩(wěn)定性。在ASFV復(fù)制周期,pA104R與DNA的相互作用并結(jié)合非常重要。二苯乙烯衍生物(Stilbene Derivatives,SD)1和SD4能破壞pA104R與DNA的結(jié)合;pA104R的β鏈DNA結(jié)合區(qū)(DNA Binding Region,DBR)的堿基突變也會(huì)消除pA104R與DNA的結(jié)合,pA104R未與DNA結(jié)合的ASFV不會(huì)進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制[11-16]。

        病豬組織細(xì)胞中存在無病毒核心的ASFV粒子,說明ASFV粒子先完成病毒內(nèi)膜、衣殼的裝配,然后形成病毒核心基因組與核蛋白完成裝配[17-18]。

        2? 核殼

        核殼位于含DNA的核仁和內(nèi)膜之間,是一個(gè)類似基質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,包裹著核心。ASFV核殼是一層30 nm厚的蛋白層,主要由多聚蛋白pp220和pp62的加工產(chǎn)物構(gòu)成。pp220和pp62的加工都依賴于主要衣殼蛋白p72的表達(dá),pp62的加工還需要pp220前體的表達(dá),pp220和pp62能夠相互作用形成核殼狀結(jié)構(gòu),這幾乎占病毒總質(zhì)量的三分之一。多聚蛋白加工是一個(gè)成熟的過程,伴隨著核心組裝,多聚蛋白pp220和pp62被S273R基因編碼的半胱氨酸蛋白酶催化,通過共有基序Gly-Gly-X有序水解成蛋白,pp220水解產(chǎn)生p150、p37、p34和p14,pp62的主要水解產(chǎn)物是p35和p15。p150、p37、p34、p14、p35和p15形成ASFV粒子的幾個(gè)主要成分,構(gòu)成病毒核殼[19-23]。

        3? 內(nèi)膜

        ASFV內(nèi)膜從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜衍生而來,依賴病毒p54,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是病毒內(nèi)膜的前體,內(nèi)膜凸面上逐漸形成二十面體衣殼,內(nèi)膜凹面上同時(shí)形成核殼[7]。

        pE248R是ASFV內(nèi)膜上的跨膜肽,在病毒外膜和蛋白衣殼破壞后,pE248R與細(xì)胞膜融合,病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),感染宿主細(xì)胞[2]。

        在幾種病毒感染中,脂質(zhì)是形成VFs的基礎(chǔ),病毒利用膜接觸位點(diǎn)(Membrane Contact Sites,MCSs)確保脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到VFs,MCSs具有提供能量轉(zhuǎn)移其他脂類的功能,如磷脂酰肌醇-4-磷酸(Phosphatidylinostol-4-Phosphate,PI4P)。PI4P在哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic Reticulum,ER)-高爾基體MCSs中由磷脂酰肌醇-4-磷酸-激酶Ⅳβ與一些同功酶如磷脂酰肌醇-4-激酶β(Phosphatidylinostol-4-Kinasesβ,PI4Kβ)或磷脂酰肌醇-4-激酶Ⅱβ(Phosphatidylinostol-4-KinasesⅡβ,PI4KⅡβ)局部產(chǎn)生。PI4P負(fù)責(zé)脂質(zhì)結(jié)合/轉(zhuǎn)移蛋白氧化淄醇蛋白(Oxysterol Binding Protein,OSBP)與高爾基體對接。MCSs中的駐留分子允許細(xì)胞器之間的非囊泡脂質(zhì)和離子交換,OSBP將膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體,在高爾基體中聚集,然后再轉(zhuǎn)運(yùn)PI4P。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中PI4P的水解為這一過程提供能量。一些研究表明,MCSs機(jī)制和PI4P依賴的固醇穿梭蛋白參與了病毒復(fù)制。病毒會(huì)招募一個(gè)宿主PI4P激酶在其復(fù)制細(xì)胞器中富集PI4P。在所有的情況下,PI4P脂質(zhì)都會(huì)促使OSBP進(jìn)入VFs,導(dǎo)致ER和VFs之間形成MCSs,在該MCSs中,膽固醇/PI4P交換驅(qū)動(dòng)膽固醇在復(fù)制位點(diǎn)的積聚[24-26]。

        ASFV pE199L是一種富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)多肽,定位于病毒的內(nèi)膜,具有細(xì)胞溶質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵。pE248R是ASFV內(nèi)膜上的另一個(gè)跨膜肽,pE248R和pE199LR與細(xì)胞膜融合,病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),形成ASFV進(jìn)入細(xì)胞的一種融合機(jī)制,感染宿主細(xì)胞[7,27]。

        p17是由三個(gè)連續(xù)α螺旋組成的蛇形結(jié)構(gòu),p17與外衣殼蛋白p72結(jié)合,緊密連接ASFV病毒內(nèi)膜與外衣殼,穩(wěn)定病毒的外衣殼結(jié)構(gòu)與形成[28]。

        4 衣殼

        ASFV粒子呈二十面體結(jié)構(gòu),由50多種衣殼蛋白組裝完成,二十面體結(jié)構(gòu)在被感染的巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)接近核附近微管組織中心(microtubule organization center)的VFs區(qū)域內(nèi)組裝形成。p72是主要的結(jié)構(gòu)蛋白,屬病毒晚期表達(dá)的蛋白,完成一個(gè)病毒粒子的衣殼裝配需要8 280多個(gè)p72,此外還需p17、M1249L、p49和H240R,其均為輔助蛋白[3,28]。

        p72以同源三聚體連接,每個(gè)單體呈雙膠卷形態(tài),使p72三聚體看起來像一個(gè)六聚體,稱為“偽六聚體”(pseudo-heameric capsomers),每一個(gè)卷含有8個(gè)反向平行的β鏈結(jié)構(gòu),并有4個(gè)暴露在外的環(huán)D1E1、D2E2、F1G1和H1I1暴露域(Exposed Regions,ERs)。這些ERs與N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal Domain,NTD)決定了病毒不同型之間的特異性差異,這與許多病毒衣殼蛋白相似。輔助蛋白p17是一種非常重要且非常豐富的蛋白,是內(nèi)膜蛋白也是衣殼蛋白,是病毒衣殼組裝和二十面體形成必需的蛋白。p17的胞外域與p72的殘基結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合,將p72帽狀體牢固地錨定在內(nèi)膜上。5個(gè)penton蛋白組成一個(gè)五聚體,骨架蛋白M1249L黏附到五聚體核心,將帽狀體連接在一起,不僅形成了一個(gè)五邊體,而且連接了兩個(gè)相鄰的五邊體形成骨架,使五聚體核心與p17可以在內(nèi)膜上移動(dòng),并與其他衣殼蛋白形成廣泛的分子間網(wǎng)絡(luò),從而推動(dòng)衣殼框架的形成。M1249L長? 100 nm,作為衣殼對稱三邊體的邊連接2個(gè)對稱的五邊體,衣殼蛋白p49(B438L)是形成衣殼頂點(diǎn)所必需的。p49是一種完整的膜蛋白,它不參與病毒粒子從病毒組裝點(diǎn)到質(zhì)膜的運(yùn)輸。p72三聚體、penton五聚體在p17、p49與M1249L的作用下形成衣殼的對稱三邊體和五邊體,20個(gè)對稱三邊體和12個(gè)對稱五邊體構(gòu)成了病毒的外衣殼[3,28-33]。

        H240R有240個(gè)殘基,富含β鏈,不同于p72,但與p72同源,具體結(jié)構(gòu)還不清楚;在外衣殼的內(nèi)膜面,還有許許多多未知的小衣殼蛋白[3,28,33]。

        衣殼組裝依賴于衣殼蛋白p72和p49(B438L)的表達(dá)以及病毒伴侶蛋白B602L的表達(dá)。靜電力在病毒衣殼的組裝過程中起著重要的作用,引導(dǎo)著衣殼小體在合適的距離和方向上相互作用,維持穩(wěn)定的組裝。組裝外衣殼蛋白的ASFV粒子直徑約200 nm[34]。

        5? 外包膜

        ASFV粒子在細(xì)胞質(zhì)的VFs中沒有外包膜,只形成四層結(jié)構(gòu),即病毒核心、核殼、內(nèi)膜和衣殼。VFs中形成的ASFV粒子在出芽時(shí)通過細(xì)胞質(zhì)膜獲得病毒外膜,從而成為一個(gè)成熟的病毒,其直徑為250 nm~300 nm。當(dāng)ASFV粒子移動(dòng)到酸性環(huán)境時(shí),病毒通過質(zhì)膜發(fā)芽獲得的外膜就消失了[2,3,35-36]。

        6? 小結(jié)

        非洲豬瘟從發(fā)現(xiàn)至今已有近100年的歷史,給養(yǎng)豬業(yè)及人類社會(huì)的公共環(huán)境帶來了非常嚴(yán)重的危害,對ASFV的研究越深入,根除ASF的目標(biāo)就越近,通過各種電鏡和分析技術(shù),我們正在逐漸剝開ASFV包裹著的一層又一層膜和蛋白,相信無ASFV的這一天一定會(huì)到來。

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