劉家奇 付孟嬌 吳海洋 田斌

摘 要：該文利用母系遺傳的葉綠體DNA片段（psbA-trnH，psbI-psbK和psbJ-petA）對黃土高原地區(qū)的特有植物蕤核（Prinsepia uniflora）進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，以揭示其現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)和群體歷史動態(tài)。結(jié)果表明：（1）蕤核自然種群總的遺傳多樣性較高（HT

=0.796），而種群內(nèi)的遺傳多樣性較低（HS =0.276）。（2）分子變異分析（AMOVA）表明，分布區(qū)域內(nèi)蕤核具有較高的遺傳分化（FST = 0.674），且遺傳變異主要存在于種群間（67.4%）。（3）Mismatch分析和基于MaxEnt的不同歷史時期生態(tài)位模擬結(jié)果表明，盡管蕤核的核心適生范圍沒有經(jīng)歷太大的變化，但其種群在最后一次大冰期結(jié)束后仍存在一定程度上的擴(kuò)張。綜上結(jié)果認(rèn)為，與大多數(shù)分布在我國北方地區(qū)的許多植物類群一樣，蕤核很可能是采取冰期在鄰近或者就地避難，冰期過后局部回遷的方式應(yīng)對第四紀(jì)的氣候波動。

關(guān)鍵詞： 蕤核， 黃土高原， 葉綠體DNA， 譜系地理學(xué)

中圖分類號：Q948.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）03-0396-08

收稿日期：2019-12-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金（41861008）? [Supported by National Natural Science Foundation of China（41861008）] 。

作者簡介： 劉家奇（1994-），碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種、植物群體遺傳，（E-mail）2047223903@qq.com。

通信作者：田斌，博士，副教授，研究方向為植物學(xué)、林木遺傳育種、植物群體遺傳學(xué)，（E-mail）tianbin@swfu.edu.cn。

Phylogeography of the Loess Plateau endemic plant Prinsepia uniflora inferred from the chloroplast DNA

LIU Jiaqi， FU Mengjiao， WU Haiyang， TIAN Bin

（ Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Southwest China （Southwest Forestry University）， Kunming 650224， China ）

Abstract：To reveal the historical dynamics of the population and existing genetic structure， maternal chloroplast DNA fragments （psbA-trnH， psbI-psbK and psbJ-petA） were used to study the phylogeography of Prinsepia uniflora， a kind of endemic plant distributed in the Loess Plateau. The results were as follows： （1） Total genetic diversity of P. uniflora was high （HT = 0.796）， but genetic diversity within species was low （HS= 0.276）; （2） The molecular variation analysis （AMOVA） showed that there was a high genetic differentiation within P. uniflora （FST = 0.674）， and the genetic variation was mainly between populations （67.4%）; （3） Mismatch analysis and MaxEnt based ecological niche simulation results in different historical periods showed that although the core suitable range of P. uniflora did not change much， population still expanded to some extent after the end of the Last Glacial Maximum （LGM）. Our study indicated that， like most of the plant groups distributed in the northern regions of China， P. uniflora probably responded to the Quaternary climatic fluctuations by taking refuge nearby or in situ during the glacial period and locally recolonizing in following post-glacial period.

Key words： Prinsepia uniflora， Loess Plateau， chloroplast DNA， phylogeography

伴隨地質(zhì)歷史事件的生物類群群體歷史動態(tài)變化對理解現(xiàn)今的生物分布和多樣性格局，以及預(yù)測未來氣候變化條件下的物種響應(yīng)有著非常重要的意義（Davis et al.，2005）。第四紀(jì)（約200萬年前）以來，全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了多次氣候的周期性波動，其典型事件是冰期和間冰期交替出現(xiàn)，對植物類群現(xiàn)今的地理分布和種群遺傳格局造成了深刻影響（Comes & Kadereit，1998;Provan & Bennett，2008）。

越來越多的證據(jù)表明，盡管以黃土高原為代表的中國北部沒有像歐洲和北美那樣大規(guī)模冰川發(fā)育的自然地理條件，但是第四紀(jì)氣候的反復(fù)變化，也對分布在這一地區(qū)的植物地理分布格局和群體遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定影響（Qiu et al.，2011;Liu et al.，2012）。其具體表現(xiàn)為種群內(nèi)遺傳多樣性降低，以及分布范圍的反復(fù)擴(kuò)張、收縮或生境破碎化。并且多數(shù)研究表明中國北方現(xiàn)存的植物物種在冰期存在多個避難所，冰期結(jié)束后也僅僅是在局部范圍內(nèi)回遷（Chen et al.，2008;Tian et al.，2009;Fu et al.，2014;Zeng et al.，2015）。

蕤核（Prinsepia uniflora）隸屬于薔薇科李亞科扁核木屬，為中國的特有植物類群。在山西、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、寧夏等黃土高原地區(qū)廣泛分布。該物種主要生于山坡、河谷等稀疏灌叢或干旱沙丘，海拔 900～1 100 m（Gu & Bartholomew，2003）。由于該物種具有一定的藥用和食用價值，加之黃土高原地區(qū)頻繁人類活動的影響，使其生存受到了嚴(yán)重的威脅。我們的野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前該物種自然群體片段化分布，并且種群內(nèi)的植株數(shù)量非常有限。本研究擬利用3套葉綠體DNA片段去構(gòu)建黃土高原特有種蕤核的譜系地理結(jié)構(gòu)，結(jié)合生態(tài)位模擬的方法，試圖為黃土高原地區(qū)植被的歷史動態(tài)提供線索，并對該物種的有效保護(hù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料于2010—2017年采自陜西、甘肅、山西、青海，共采集蕤核18個種群144個個體（表1，圖1）。每個種群隨機(jī)采集4～13個個體，個體之間相隔至少100 m以上。采集生長良好植株的新鮮嫩葉后立即用硅膠干燥，帶回實驗室存放于-20 ℃冰箱備用。憑證標(biāo)本貯藏于西南林業(yè)大學(xué)標(biāo)本館。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用改良的CTAB法（Doyle JJ & Doyle JL，1990）提取所有采集樣本葉片的總DNA。從候選的10對cpDNA通用引物篩選出具有多態(tài)性的引物，最終甄選出3對cpDNA引物（psbA-trnH、psbJ-petA、trnL-trnF）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含2Taq MasterMix（Sangon Biotech）12.5 μL、正反向引物各1 μL（濃度為5 μmol·L-1）、植物總DNA模板1 μL以及雙蒸水9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸7 min結(jié)束，4 ℃保存。多次實驗篩選出3對引物最佳的退火溫度均為52 ℃。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測序公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)測序后得到的數(shù)據(jù)使用ClustalX 1.83 （Thompson et al.，1997）以及MEGA 7.0.26 （Kumar et al.，2016）進(jìn)行序列的多重比對，同時將原始峰圖作為參照進(jìn)行手工校對。所有的序列完全校對正確后，再用DnaSP 5.10 （Librado & Rozas，2009）程序來統(tǒng)計葉綠體DNA單倍型。

葉綠體DNA單倍型的關(guān)系通過NETWORK 4.1.6.3 （Bandelt et al.，1999）軟件來檢測。我們選擇最大簡約法以最小生成樹為基礎(chǔ)構(gòu)建單倍型中央連接網(wǎng)狀圖。在分析過程中點(diǎn)突變和缺失被平等處理，并且假設(shè)每個突變之間是相對獨(dú)立的。種群內(nèi)遺傳多樣性（HS）、總遺傳多樣性（HT）和物種層面上的種群分化水平GST和NST值均使用PERMUT （Pons & Petit，1996）軟件來估測和觀察葉綠體的變異情況。GST值計算只使用了單倍型頻率，而NST值則把單倍型之間的差異也計算在內(nèi)。比較這兩個值可以看出單倍型變異在整個地理分布區(qū)的地理格局，如果NST值大于GST值，且達(dá)到顯著水平（P < 0.05），則表明關(guān)系相近的單倍型在相同的種群出現(xiàn)比在不同種群出現(xiàn)幾率大，說明存在著明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。采用Arlequin 3.5.2 （Weir & Cockerham，1984）軟件的分子變異分析（analysis of molecular variance，AMOVA）對種群間和種群內(nèi)的遺傳差異進(jìn)行估算，其中顯著性檢驗使用隨機(jī)參數(shù)進(jìn)行1 000次的置換檢驗。

1.4 生態(tài)位模擬

本研究通過最大熵模型（Phillips et al.，2006） （Maximum entropy;Maxent）對蕤核進(jìn)行生態(tài)位模型預(yù)測來識別該物種在第四紀(jì)時的避難所和避難模式，推測大冰期后至今的歷史動態(tài)，以及未來在全球變暖的趨勢下該物種的潛在分布。蕤核的當(dāng)前分布數(shù)據(jù)主要來自我們的野外調(diào)查采樣以及植物標(biāo)本館記錄（www.cvh.ac.cn）。在去除重復(fù)的分布點(diǎn)后，得到35個當(dāng)前的分布位置。基于4個時期（Last Interglacial，LIG、Last Glacial Maximum，LGM、Present and Future）背景下的各自19個氣候變量從WorldClim數(shù)據(jù)庫下載（www.worldclim.org），分辨率和大氣環(huán)流模型分別統(tǒng)一為2.5 arc-min （大約5 km）和CCSM4。根據(jù)Pearsons相關(guān)系數(shù)（r>0.9），對當(dāng)前19個氣候變量中具有強(qiáng)相關(guān)性的變量排除，剩下的9個氣候變量用于模型創(chuàng)建。生態(tài)位模型創(chuàng)建在Maxent 3.3.3中進(jìn)行，設(shè)置Random test percentage為25%，Replicates為10。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕤核的單倍型分布

對蕤核cpDNA的3個片段psbA-trnH、psbJ-petA和psbK-psbI進(jìn)行擴(kuò)增測序的結(jié)果顯示：3個片段各出現(xiàn)1個、4個、1個變異位點(diǎn)（表3）。經(jīng)過序列比對后的psbA-trnH、psbJ-petA和psbK-psbI 3對引物片段長度分別為495、801、244 bp，這3套葉綠體DNA片段的序列拼接在一起可得到1 540 bp的長度，一共識別出7種葉綠體單倍型H（1-7），存在5個點(diǎn)突變和4處插入缺失。

從蕤核葉綠體單倍型的分布圖（圖1）可以看出，共計8個種群只存在1種單倍型，另外有9個種群有2種單倍型，僅在1個種群中存在3種單倍型RLXX（H4、H5、H6）。單倍型H4出現(xiàn)的頻率最高。單倍型網(wǎng)狀圖顯示蕤核的單倍型成多元擴(kuò)張分布，主要是以單倍型H4和H5為中心，由單倍型H4和H5向四周發(fā)散，然后衍生出單倍型H2、 H3這2個大的分布類型，并且多數(shù)單倍型之間僅有一步的變異（圖1）。

2.2 蕤核遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析

從表4可以看出，蕤核種群內(nèi)遺傳變異百分比為32.59%，種群間遺傳變異量占總變異量的67.41%，種群間發(fā)生顯著的遺傳分化，F(xiàn)ST=0.674 12（表4，P<0.001）。通過PREMUT程序計算得出其自然種群間遺傳多樣性HT（0.796）高于種群內(nèi)的遺傳多樣性HS（0.276）。從所有的18個種群地理單元間遺傳變異性和分化系數(shù)顯示出NST（0.834）顯著高于GST（0.654）（P<0.01）。結(jié)果顯示，蕤核葉綠體單倍型有明顯的譜系地理學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.3 蕤核種群歷史分析

葉綠體單倍型的種群錯配的分布顯示單峰型（圖2），表明了蕤核種群經(jīng)歷了種群的急速擴(kuò)張性事件?；谟嬎闼玫摩又禐?.516，根據(jù)τ=2ut計算擴(kuò)張經(jīng)歷世代數(shù)t，其中u=2μkg。通過野外觀察，我們設(shè)定世代長度g為3 a，μ代表DNA平均變異速率，采用木本植物的進(jìn)化速率，取已發(fā)表的平均變異速率的較高值：3～9×10-9變異/位點(diǎn)/年（substitution/site/year）。k表示序列總長度為1 540。計算得到擴(kuò)張時間為18 614～8 272年前。

2.4 生態(tài)位模擬分析

生態(tài)位模型創(chuàng)建結(jié)果獲得了非常高的AUC（the Area Under the Curve）值（> 0.995）的支持。蕤核4個時期的潛在分布預(yù)測圖中清晰地展現(xiàn)了該物種在不同氣候背景下的分布格局。與現(xiàn)在（Present）的分布范圍相比，LIG和LGM時種群范圍并沒有出現(xiàn)較大的變化，其分布的核心區(qū)均在黃土高原，只是在最后一次冰期后出現(xiàn)了小幅度的適生區(qū)擴(kuò)大。然而在未來（2070年）蕤核的分布范圍將會縮?。▓D3）。

氣候因子Bio6（最冷月最低溫）和Bio15（降水季節(jié)變化）在生態(tài)位建模的4個時期，都表現(xiàn)出較高的貢獻(xiàn)率，尤其是LIG，Bio15的貢獻(xiàn)百分比達(dá)到了37.4%（圖4）。此外，Bio16（最濕季節(jié)降水量）、Bio13（最濕月降水量）和Bio14（最干月降水量）在現(xiàn)在和未來（Future）蕤核分布區(qū)模擬中占有較高的貢獻(xiàn)百分比（圖4）。

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)蕤核具有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)（NST = 0.834 >GST = 0.654， P < 0.01），并且有顯著的遺傳分化（FST=0.674 12， P<0.001）和較低的種群內(nèi)遺傳多樣性（HS=0.276）。分子變異遺傳方差分析（AMOVA）的結(jié)果顯示，蕤核遺傳變異主要以種群間的變異為主，占67.41%。總的來說，植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)受到地質(zhì)歷史氣候變遷、環(huán)境因素（如地勢條件、生境異質(zhì)性）以及種子基因交流程度等諸多因素的影響。已有的研究表明，我國北方分布的植物類群由于第四紀(jì)冰期與間冰期的反復(fù)交替造成不同避難所之間的種群產(chǎn)生強(qiáng)烈的遺傳分化，并且降低了種群內(nèi)的遺傳多樣性（Qian & Ricklefs，2000;Chen et al.，2008;Qiu et al.，2011;Zeng et al.，2015）。此外，我們在野外采樣過程中發(fā)現(xiàn)，蕤核現(xiàn)存的自然種群大多零星分布在黃土高原的中高海拔地區(qū)，種群規(guī)模相對較小。黃土高原溝壑縱橫的地貌和嚴(yán)重的水土流失可能加劇了蕤核不同種群之間的基因交流困難性，使得種群之間具有較大的遺傳分化。黃土高原地區(qū)長期而劇烈的人類活動可能是造成上述結(jié)果的另一重要原因。

從蕤核單倍型的network分析和地理分布來看，兩種古老單倍型H4和H5從東到西均有分布，其他衍生單倍型則是局限地分布于不同的地理區(qū)域，如單倍型H1、H3和H7僅分布在分布區(qū)西部的少數(shù)幾個種群。生態(tài)位模擬的結(jié)果也表明，在最后一次大冰期蕤核并沒有大規(guī)模的分布區(qū)范圍變化。Mismatch分析（錯配分析）表明蕤核種群經(jīng)歷了近期的擴(kuò)張事件。經(jīng)推算的擴(kuò)張時間為1.86萬～0.82萬年前，這與第四紀(jì)最后一次大冰期結(jié)束的時間（1.8萬～1.6萬年前）相吻合。因此，我們推測該物種在最后一次大冰期時，并沒有大規(guī)模的滅絕事件發(fā)生，而是在多個冰期避難所就地避難。不同地區(qū)避難的種群也很可能沒有經(jīng)歷大范圍的擴(kuò)張，僅僅回遷到鄰近地區(qū)。這一推測也和在該地區(qū)分布的其他重要樹種如虎榛子（Ostryopsis davidiana）（Tian et al.，2009）、 連翹（Forsythia suspensa） （Fu et al.，2014）、文冠果（Xanthoceras sorbifolium）（Zhu et al.，2019）等的研究結(jié)果相類似。本研究同樣支持了我國北方地區(qū)的許多植物類群并沒有像同緯度歐洲分部的植物一樣出現(xiàn)大規(guī)模的南遷避難，而是多采取鄰近或者就地避難的方式應(yīng)對第四紀(jì)的氣候波動。

全球氣候變化下，很多生態(tài)敏感地區(qū)的動植物都有遺傳多樣性喪失甚至滅絕的風(fēng)險（Vellend & Geber，2005）。對于黃土高原這一生態(tài)脆弱地區(qū)來說，分布在這一地區(qū)的特有動植物類群應(yīng)該備受關(guān)注。我們對蕤核生態(tài)位模擬的結(jié)果顯示，不同的歷史時期，降水相關(guān)的生態(tài)因子都表現(xiàn)出較高的貢獻(xiàn)率。在未來全球氣候?qū)霈F(xiàn)的增溫變干的趨勢下，蕤核適生范圍有可能急劇減小。加之其生存的黃土高原地區(qū)特殊的生境和強(qiáng)烈的人為干擾，這一黃土高原特有植物類群將面臨滅絕風(fēng)險。結(jié)合蕤核種群遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果，該物種具有較高的遺傳分化水平，并且多個種群均出現(xiàn)了獨(dú)有的葉綠體單倍型。因此，我們認(rèn)為蕤核的多數(shù)種群均有保護(hù)價值，一方面應(yīng)對現(xiàn)有的蕤核群體進(jìn)行有效的保護(hù)，另一方面應(yīng)加大對蕤核遺傳資源的收集，進(jìn)行入庫保存。

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（責(zé)任編輯 何永艷）