郝焰平，姜春武，陳雪蓮，潘婷，韋薔，徐六一

(安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，松材線蟲病預(yù)防與控制技術(shù)國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230088)

馬尾松Pinus massoniana是我國針葉林面積中分布最廣的樹種[1－2]。松材線蟲病是危害馬尾松等松屬樹種的主要病害[3－4]。針對松材線蟲病的各項(xiàng)研究目前都取得了一些階段性的成果，但在實(shí)際生產(chǎn)中還沒有特別有效的防治措施，防治松材線蟲病的形勢依然嚴(yán)峻[5－9]。

松材線蟲病由于其發(fā)病因素和傳播擴(kuò)散途徑復(fù)雜、危害嚴(yán)重、防治困難，目前對該病害的防治主要是嚴(yán)格檢疫、清除枯死木和用天敵、化學(xué)農(nóng)藥防治該病的主要傳播媒介松褐天牛[10－14]，對病害的控制尚未取得根本性的進(jìn)展。因此，開展松材線蟲病馬尾松抗性育種研究，選育出抗性品種，已成為防御松材線蟲病危害的重要途徑之一[15]。

1 材料與方法

1.1 選育地概況 “皖抗6號”等6個抗松材線蟲病馬尾松無性系選育地包括3個地點(diǎn):合肥市廬陽區(qū)林業(yè)科技示范園、滁州市全椒縣瓦山國有林場和滁州市南譙區(qū)安徽省林業(yè)科學(xué)研究院沙河林木良種繁育中心。

合肥林業(yè)科技示范園(31°55′N，117°12′E)地處合肥市廬陽區(qū)大楊鎮(zhèn)董鋪水庫北緣，屬暖溫帶季風(fēng)大陸性氣候，四季分明、氣候溫和、日照充足。全年無霜期227 d，年平均氣溫15～15.7℃，年均日照時數(shù)為2 112 h左右，年平均降雨量986～1 300 mm，降雨量季節(jié)分配不均勻，主要集中在5—9月。園區(qū)土壤為粘盤黃棕壤，土層深厚(60～200 cm)，但質(zhì)地黏重，理化條件較差，肥力低。

全椒縣瓦山林場(32°10′N，117°50′E)位于滁州市全椒縣西王鎮(zhèn)，安徽省林業(yè)科學(xué)院沙河林木良種繁育中心(32°24′N，118°15′E)位于滁州市南譙區(qū)沙河鎮(zhèn)，兩地均屬暖溫帶向亞熱帶過渡的氣候型，為亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，其主要?dú)夂蛱卣魇?季風(fēng)明顯、四季分明、氣候溫和、雨量適中、春溫多變、秋高氣爽、梅雨顯著、夏雨集中。年平均降雨量1 000 mm，年平均氣溫15.3℃，無霜期215 d。土壤為灰綠色千枚巖發(fā)育而來的普通黃棕壤，土壤pH值6.5，肥力中等，非常適于馬尾松生長發(fā)育。

1.2 選育親本來源 2001—2008年，項(xiàng)目組開展了馬尾松松材線蟲病抗性育種研究工作[16]，在安徽省和縣、廣德縣、滁州市、宣州區(qū)、涇縣、休寧縣、黃山區(qū)、全椒縣、潛山縣和太湖縣等10個縣(區(qū))的松材線蟲病疫區(qū)和非疫區(qū)選擇馬尾松抗病優(yōu)樹324株，通過采種、育苗，連續(xù)2 a的人工接種松材線蟲測定評價(jià)，初選出251個馬尾松抗性候選家系，每個家系擇優(yōu)保存4～5株，共初選出1 201株馬尾松抗性候選單株。2009—2019年，將選育出的1 201株抗性候選單株分別采取穗條，通過嫁接的方法培育馬尾松無性系苗木，通過連續(xù)2 a人工接種松材線蟲測定評價(jià)，篩選出89個馬尾松松材線蟲病抗性無性系[17]。 (圖1)

圖1 抗性無性系選育技術(shù)路線圖Fig.1 Technical roadmap for selection and breeding of resistant clones

1.3 母樹選優(yōu) 根據(jù)各地林業(yè)部門提供的資料，在20～30 a生、林分面積在30 hm2以上且該林分曾發(fā)生或正在發(fā)生松材線蟲病危害的馬尾松林分，或不考慮松材線蟲病發(fā)生與否，選擇林分面積在80 hm2以上的馬尾松純林作為采種林分。在采種林分中，為保證有良好的遺傳增益，優(yōu)良單株選擇方法為“5株優(yōu)勢木法”[18]，即選擇的優(yōu)良家系，其樹高、胸徑和材積生長量超眾，其單株材積比同一標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)3～5株優(yōu)勢木的平均材積大50%以上。樹冠較窄，不超過樹干高度的1/3～1/4，均勻?qū)ΨQ，側(cè)枝細(xì)而短。樹干通直圓滿，自然整枝良好，無大的枯死節(jié)，枝下高為樹干總長的2/3以上，樹體良好。樹皮較薄，裂紋通直，木材密度較大，容重較重，年輪的晚材比率大，干材品質(zhì)好。樹木健康，無病害感染，生長態(tài)勢好。樹齡20～30 a，各項(xiàng)性狀較為穩(wěn)定。

1.4 營建馬尾松抗性無性系種子園及子代測定林 在安徽省林科院沙河林木良種繁育中心營建馬尾松抗性無性系種子園，種子園規(guī)模1.6 hm2。依據(jù)道路和地形地勢將抗松材線蟲病馬尾松無性系種子園劃分為7個小區(qū)，每小區(qū)面積不等，約0.2 hm2；種子園無性系配置方式采取完全隨機(jī)排列，在排列過程中，同一無性系各個體間距離應(yīng)間隔3株以上或大于20 m，小區(qū)無性系配置數(shù)目82～89個，種子園的栽植密度4 m×6 m；建園材料來自經(jīng)過2次人工接種松材線蟲后篩選出的抗性無性系，共89個無性系，其中Ⅰ～Ⅵ小區(qū)為89個無性系，Ⅶ小區(qū)為82個無性系；種子園采用大穴整地，規(guī)格0.8 m×0.8 m ×0.6 m，株行距為 4.0 m ×6.0 m，420株/hm2；建園無性系單株采取預(yù)先培育嫁接苗法，第1年培育嫁接苗，第2年、第3年分別人工接種松材線蟲1次，再選擇經(jīng)過2 a接種松材線蟲沒有出現(xiàn)死亡的抗性無性系移栽營建種子園。無性系植株帶土球30～40 cm，定植后澆透水并適當(dāng)修剪。

建園后前3 a每年5月、9月松土除草各1次，并結(jié)合撫育施肥，對缺棵植株適時補(bǔ)植。對抗性馬尾松無性系種子園的主要病蟲害進(jìn)行人工撲殺或化學(xué)防治。建立完整的種子園技術(shù)檔案，包括文字材料、栽植配置圖與實(shí)地標(biāo)樁標(biāo)記。每年對種子園樹木生長情況進(jìn)行調(diào)查，包括樹高、胸徑、樹冠的生長情況以及松材線蟲病危害情況，分無性系調(diào)查統(tǒng)計(jì)，同時做好檔案管理工作。

當(dāng)種子園母樹開始結(jié)實(shí)后，從中選擇表現(xiàn)性狀優(yōu)良的無性系進(jìn)行采種，營建馬尾松抗性子代測定林。2010年和2011年秋季，采集馬尾松抗性候選家系中已結(jié)實(shí)的家系種子；于2011年和2012年分家系播種育苗，培育出抗性馬尾松候選家系子代苗木6 000多株，于育苗后的次年開展人工接種松材線蟲測定，115個馬尾松抗性候選家系的子代人工接種松材線蟲測定表明，接種后兩個月只有4個家系出現(xiàn)感病癥狀，但未出現(xiàn)整株枯死現(xiàn)象。

2012年和2013年春季在全椒縣瓦山林場松材線蟲病危害區(qū)分別營建了56個和59個馬尾松抗性候選家系子代測定林0.4 hm2和0.7 hm2，造林密度2 m×3 m，6株單行小區(qū)，3次重復(fù)，對照樹種為普通馬尾松、火炬松。目前115個馬尾松抗性家系的子代在疫區(qū)長勢良好，8 a生平均樹高4.0 m，平均胸徑7.7 cm，7 a生平均樹高3.2 m，平均胸徑6.4 cm。

1.5 馬尾松抗性無性系區(qū)域化試驗(yàn) 2011年春季，利用70個松材線蟲病抗性無性系，在長豐縣崗集鎮(zhèn)合肥禾景農(nóng)林科技發(fā)展有限公司營建馬尾松無性系現(xiàn)地測定林1.3 hm2，造林密度2 m×3 m，5株小區(qū)，6次重復(fù)。

2012年春季，利用初選出健全率(健全率為接種后健全的株數(shù)占全部接種株數(shù)的百分比)超過火炬松的抗松材線蟲病馬尾松212個無性系(包括抗性最強(qiáng)的89個無性系)以及抗性弱的74個無性系，共286個無性系，對照樹種為火炬松和普通馬尾松，在疫區(qū)全椒縣瓦山林場松材線蟲病危害區(qū)營建了馬尾松無性系現(xiàn)地測定林1.2 hm2，造林密度2 m×3 m，單株小區(qū)，6次重復(fù)。

2014年春季，利用27個松材線蟲抗性無性系，在松材線蟲病危害區(qū)桐城市金神鎮(zhèn)安徽環(huán)藝生態(tài)園林工程有限公司營建了馬尾松無性系現(xiàn)地測定林0.3 hm2，造林密度2 m×3 m，3株小區(qū)，7次重復(fù)。

2011年春季，利用松材線蟲病抗性最強(qiáng)的68個馬尾松家系、89個無性系，在安徽省林科院沙河林木良種繁育中心營建馬尾松松材線蟲病抗性無性系種子園1.6 hm2，造林密度4 m×6 m，單株小區(qū)，7次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松抗性無性系區(qū)域化試驗(yàn)結(jié)果 通過多年連續(xù)觀測，位于長豐縣崗集鎮(zhèn)的各參試無性系長勢良好，在自然環(huán)境下未受到松材線蟲病危害，9 a生平均樹高5.5 m，平均胸徑11.3 cm；其中“皖抗6號”等6個抗性無性系生長量表現(xiàn)突出，平均樹高達(dá)6.5 m，平均胸徑達(dá)12.4 cm。全椒縣瓦山林場各參試無性系在松材線蟲病疫區(qū)環(huán)境下仍未受到松材線蟲病危害，而周邊有約40%～50%的松材線蟲病死樹。8 a生平均樹高4.8 m，平均胸徑9.6 cm；其中“皖抗6號”等6個抗性無性系生長量表現(xiàn)突出，平均樹高達(dá)5.0 m，平均胸徑10.4 cm。桐城市金神鎮(zhèn)各參試無性系生長良好，在松材線蟲病疫區(qū)環(huán)境下仍未受到松材線蟲病危害，而周邊有60%左右的松材線蟲病死樹。6 a生平均樹高3.9 m，平均胸徑6.5 cm；其中“皖抗6號”等6個抗性無性系生長量表現(xiàn)突出，平均樹高達(dá)4.3 m，平均胸徑8.2 cm。安徽省林科院沙河林木良種繁育中心各參試無性系生長良好，在松材線蟲病疫區(qū)環(huán)境下仍未受到松材線蟲病危害，而周邊有50%左右的松材線蟲病死樹。10 a生平均樹高5.7 m，平均胸徑13.8 cm；其中“皖抗6號”等6個抗性無性系生長量表現(xiàn)突出，平均樹高達(dá)6.4 m，平均胸徑16.4 cm。

2.2 “皖抗6號”等6個抗性無性系特性 項(xiàng)目組選育的“皖抗6號”等6個抗松材線蟲病馬尾松無性系2 a人工接種松材線蟲后健全率為100%，對松材線蟲病具有較高的抗性?！巴羁?號”特性主要表現(xiàn)在生長量、千粒重和室內(nèi)發(fā)芽率上，其平均單株材積比同期無性系增益65.8%，比普通馬尾松增益192.8%，種子千粒重比同期抗性無性系高8.1%，室內(nèi)發(fā)芽率95%?！巴羁?號”尤其在樹干通直度上特異性表現(xiàn)明顯，均為Ⅰ級木?！巴羁?號”特性表現(xiàn)在其母株穗條的扦插生根率達(dá)95%，成苗率達(dá)90%以上?！巴羁?號”特性主要表現(xiàn)在該無性系結(jié)實(shí)量穩(wěn)定，前期結(jié)實(shí)量呈遞增趨勢。“皖抗10號”特性表現(xiàn)在種子純度高，達(dá)到97.9%，球果大小也高于其他同期無性系?！巴羁?1號”特性表現(xiàn)在冠型優(yōu)美、樹干通直度均為Ⅰ級木。室內(nèi)MuPS實(shí)驗(yàn)表明:“皖抗6號”等6個無性系與其他抗性無性系均存有差異性基因位點(diǎn)。

2.3 “皖抗6號”等6個抗性無性系優(yōu)良性狀 根據(jù)馬尾松種子園調(diào)查結(jié)果(采用的是10 a生林木調(diào)查記錄)，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，得出“皖抗6號”等6個抗性無性系具有抗逆性、速生豐產(chǎn)性、干型通直、冠幅冠層較大、種實(shí)品質(zhì)較好、基因差異性明顯等優(yōu)良性狀。

抗逆性強(qiáng)。馬尾松具有耐干旱瘠薄的特性，能夠在－15℃以內(nèi)的溫度環(huán)境下正常生長。“皖抗6號”等6個良種除了生長迅速、干形通直外，對松材線蟲病具有較強(qiáng)的抗病性。2015年國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“抗松材線蟲病馬尾松種源及抗性育種技術(shù)研究”結(jié)果表明，項(xiàng)目組選育的89個抗松材線蟲病馬尾松無性系平均健全率為93.4%，而對照樹種普通馬尾松平均健全率僅為29.7%，抗性無線無性系株發(fā)病率比普通馬尾松減少了63.7個百分點(diǎn)，其中“皖抗6號”等6個無性系健全率達(dá)到100%，株發(fā)病率比對照減少70.3個百分點(diǎn)。

速生豐產(chǎn)性良好。馬尾松抗性種子園各無性系生長都較好，10 a生馬尾松平均樹高、胸徑、單株材積分別為5.7 m、13.8 cm、0.048 9 m3。 “皖抗6號”等6個高抗無性系的平均樹高、胸徑、單株材積分別為6.4 m、16.4 cm、0.074 8 m3；6 個高抗無性系的平均樹高、胸徑、單株材積比抗性種子園無性系全體平均值分別增益12.3%、18.8%和53.0%，比對照普通馬尾松分別增益16.4%、51.2%和170.0%，說明遺傳增益的潛力是較大、穩(wěn)定而可靠的，“皖抗6號”等6個高抗無性系具有速生豐產(chǎn)性。尤其是“皖抗6號”平均單株材積比同期無性系增益65.8%，比普通馬尾松增益192.8%，特異性明顯。(表1)

表1 抗性馬尾松無性系種子園生長量Tab.1 Growth of resistant masson pine clones in the seed orchard

干形通直，冠幅、冠層均較厚。10 a生馬尾松無性系種子園，這時樹干通直與否，已經(jīng)成型，這是受遺傳基因控制的，此時進(jìn)行測定比較符合實(shí)際。全園參試的89個無性系其樹干通直度總體良好，全園I級木達(dá)到71.4%，Ⅱ級木14.3%，Ⅲ級木14.3%；平均冠幅和冠層厚度分別為5.1 m和4.7 m。“皖抗6號”等6個高抗無性系中I級木達(dá)到90.5%；Ⅱ級木9.5%；平均冠幅和冠層厚度分別為6.5 m和5.6 m。尤其是“皖抗7號”和“皖抗11號”在樹干通直度上特異性表現(xiàn)明顯，均為Ⅰ級木，“皖抗11號”冠幅和冠層厚度高于其他同期無性系，冠型優(yōu)美。(表2)

表2 種子園無性系的樹干通直度及冠幅、冠層厚度Tab.2 Trunk straightness，crown width and canopy thickness of clones in seed orchard

結(jié)實(shí)穩(wěn)定、高產(chǎn)。由于建園材料經(jīng)多層次的選擇，故樹體生長、發(fā)育良好，加之集約經(jīng)營管理和合理的定植密度，所以種子園從第1年(2011年)起即開花結(jié)實(shí)，9年間產(chǎn)種量漸次增加，即年際間呈穩(wěn)定上升的趨勢，相對于結(jié)實(shí)第1年而言，2019年產(chǎn)量是其10.9倍，前期結(jié)實(shí)量呈遞增趨勢，表明種子園產(chǎn)種量的穩(wěn)定性。尤其是“皖抗9號”結(jié)實(shí)量穩(wěn)定，前期結(jié)實(shí)量呈遞增趨勢最為明顯。(表3)

表3 從結(jié)實(shí)始種子園歷年產(chǎn)籽量Tab.3 Annual seed production from the beginning of fruiting in the seed orchard

種實(shí)品質(zhì)好，使用價(jià)值高。2019年度各無性系球果大小、種子千粒重、純度和室內(nèi)發(fā)芽率等項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定分析表明，“皖抗6號”等6個高抗無性系的平均球果大小、千粒重、純度、室內(nèi)發(fā)芽率均高于其他同期無性系。尤其是“皖抗6號”種子千粒重比同期抗性無性系高8.1%，室內(nèi)發(fā)芽率達(dá)95%；“皖抗10號”種子純度高，達(dá)97.9%，特異性明顯。(表4)

表4 種子園抗性無性系種實(shí)品質(zhì)測定分析Tab.4 Determination and analysis of seed quality of resistant clones in seed orchard

種子園89個無性系其球果直徑平均為3.28 cm、果長平均為6.38 cm，球果大小平均值和球果含籽數(shù)在正常值的范圍以內(nèi)，表明種子園球果性狀發(fā)育良好?！巴羁?號”等6個良種球果平均直徑為3.77 cm，果長平均為7.47 cm，超出種子園平均值14.9%和17.1%。種子園89個無性系球果千粒重平均為13.29 g。其中“皖抗6號”等6個優(yōu)良無性系的平均千粒重為13.65 g，超出種子園平均值2.7%，表明“皖抗6號”等6個無性系種子飽滿度高，可育性強(qiáng)，播種品質(zhì)好。種子純度是種子品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，經(jīng)測定，種子園89個無性系其種子平均純度為96.14%，其中“皖抗6號”等6個優(yōu)良無性系種子平均純度為97.09%。按馬尾松種子Ⅰ級種純度為96%的指標(biāo)來衡量，種子園種子純度為上等，可謂是品質(zhì)好、使用價(jià)值高的種子，“皖抗6號”等6個無性系種子品質(zhì)更好、具有更高的使用價(jià)值。種子園89個無性系種子室內(nèi)發(fā)芽率平均為88.34%，其中“皖抗6號”等6個優(yōu)良無性系種子室內(nèi)發(fā)芽率平均為91.8%。表明種子園生產(chǎn)的種子生活力強(qiáng)、發(fā)芽率高，具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值，“皖抗6號”等6個無性系種子發(fā)芽率更高，具有更好的推廣價(jià)值。

基因差異性明顯。項(xiàng)目組對全部1 201個抗性無性系進(jìn)行MuPS型分析，成功建立了1 163個無性系的MuPS型數(shù)據(jù)庫[19]。1 163個無性系的樣品中獲得783個不同的MuPS型，區(qū)分率67.3%。在174個抗性水平超過火炬松的無性系中獲得130個不同的MuPS型，其中單一的MuPS型單株有102株，58.6%的無性系完全能夠識別。14對引物建立的基因數(shù)據(jù)庫顯示，“皖抗6號”等6個無性系與其他抗性無性系存有差異性基因位點(diǎn)，且相互間也存有差異性基因位點(diǎn)。(圖2、圖3)

圖2 M1引物組對64個樣品的多態(tài)型檢測Fig.2 Polymorphism detection of 64 samples by M1 primer set

圖3 M2引物組對64個樣品的多態(tài)型檢測Fig.3 Polymorphism detection of 64 samples by M2 primer set

扦插生根率高。2017年采用全光照自動噴霧扦插技術(shù)，對選育出的抗松材線蟲病馬尾松無性系開展了扦插試驗(yàn)，突破了馬尾松扦插?；旆钡年P(guān)鍵技術(shù)[20]。2019年，利用馬尾松1～2 a生母樹半木質(zhì)化穗條扦插生根率平均為92%，成苗率平均為86%。尤其是“皖抗8號”特異性表現(xiàn)明顯，其母株穗條的扦插生根率達(dá)95%，成苗率達(dá)90%以上。

3 結(jié)論與討論

“皖抗6號”等6個抗性無性系具有抗逆性、速生豐產(chǎn)性、干型通直、冠幅冠層較大、種實(shí)品質(zhì)較好、基因差異性明顯等優(yōu)良性狀?！巴羁?號”結(jié)實(shí)量穩(wěn)定，前期結(jié)實(shí)量呈遞增趨勢最為明顯，“皖抗8號”扦插生根率高。上述性狀是采用馬尾松種子園10 a生的林木進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)和試驗(yàn)后得出的結(jié)果，隨著樹齡的增長，后期還要持續(xù)跟蹤調(diào)查和試驗(yàn)，以便得出“皖抗6號”等6個抗性無性系的優(yōu)良性狀具有持續(xù)穩(wěn)定性。

“皖抗6號”等6個抗松材線蟲病馬尾松無性系適應(yīng)性廣泛，可在安徽省淮河以南松材線蟲病疫區(qū)栽植和推廣。