邵松軍，段玲弟，張湘燕，葉賢偉，饒珊珊，汪國雨，龍運(yùn)芝

1貴州省人民醫(yī)院，貴陽520100；2國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫性疾病診治重點(diǎn)實驗室；3合肥市第二人民醫(yī)院

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者占全部肺癌患者的85%以上，生存率比較低［1］。肺腺癌細(xì)胞的侵襲遷移是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的重要原因，因此深入研究細(xì)胞遷移機(jī)制以及尋找有效的藥物治療靶點(diǎn)迫在眉睫。Wnt1因子是Wnt家族成員之一，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肺癌中Wnt1高表達(dá)，并且其可通過介導(dǎo)Wnt/βcatenin信號通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞失去上皮極性而獲得間充質(zhì)表型，進(jìn)而增強(qiáng)肺癌的侵襲與遠(yuǎn)處遷移［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸羥化酶3可通過活化Wnt/βcatenin信號通路促使肺腫瘤細(xì)胞間質(zhì)膠原沉積，通過促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲遷移。以上研究表明Wnt1因子可通過激活Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控肺癌的侵襲遷移。

蘿卜硫素（SFN）是從花椰菜等十字花科植物中提取的一種異硫氰酸鹽，具有抗氧化、抗癌、降低血糖等功效，有很好的食用價值和藥用價值。近年研究發(fā)現(xiàn)，口服SFN可有效預(yù)防胃癌、膀胱癌的發(fā)生［3-4］，并且通過抑制Akt/mTOR通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖［5-6］，但目前關(guān)于SFN對肺腺癌的侵襲遷移的作用及機(jī)制尚未見報道。2018年10月—2019年12月，我們觀察了SFN對肺腺癌A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為NSCLC的防治提供新藥物治療靶點(diǎn)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑、儀器肺腺癌A549細(xì)胞（廣州吉尼歐生物科技有限公司）；SFN（Sulforaphane）（美國MCE公司），Wnt1刺激因子（美國PeproTech公司）；MTT試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），DMEM培養(yǎng) 基（5.5 mmol/L glucose）、胎 牛 血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（澳洲Gibco公司），Anti-Wnt1（英國Abcam公司），Anti-β-catenin（美國Pro‐teintech公司），β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢普瑞美斯生物有限公司），Transwell細(xì)胞小室、Matrigel基質(zhì)膠（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），酶標(biāo)檢測儀（Thermo MK3型），搖床（Qilinbeier TS-1000），免疫印跡實驗電泳儀（北京六一儀器廠），凝膠電泳成像儀（Bio-Rad）。

1.2 肺腺癌A549細(xì)胞分組、SFN的加入方法A549細(xì)胞加入濃度分別為0、5、10、20、40、80μmol/L的SFN后采用MTT法［6］檢測細(xì)胞活性，A549細(xì)胞存活 率依次 為100%、90.33%±3.51%、83.33%±4.04%、78.00%±2.65%、41.33 %±7.09%以 及14.00%±5.29%，與SFN 0μmol/L比較，SFN 5、10、20、40、80μmol/L干預(yù)后A549細(xì)胞活力降低（P均＜0.05）。最終選定20 μmol/L作為本實驗中SFN的濃度。

肺腺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。A549細(xì)胞分為對照組、模型組及干預(yù)組，對照組采用10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，模型組10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)并給予Wnt1 5 μmol/L刺激細(xì)胞48 h，干預(yù)組采用10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)并給予Wnt1 5 μmol/L+SFN 20 μmol/L干預(yù)細(xì)胞48 h。

1.3 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測①細(xì)胞遷移能力采用細(xì)胞劃痕實驗檢測。將A549細(xì)胞制成5×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，除去培養(yǎng)基，無菌PBS洗1遍，用100 μL移液器槍頭沿6孔板底部垂直畫一條直線，無菌PBS洗2遍，根據(jù)分組加相應(yīng)的藥物，每孔培養(yǎng)基2 mL，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用倒置顯微鏡拍攝記錄給藥后0 h、48 h各孔的距離。細(xì)胞遷移抑制率=［0 h遷移距離-48 h遷移距離］/0 h遷移距離］［7-8］。②細(xì)胞侵襲能力檢測采用Transwell實 驗。Transwell小 室 膜 底 部 用Matrigel稀釋膠包被、水化，把培養(yǎng)基（含20% FBS）加入24孔板內(nèi)，將Transwell小室置24孔板中，用含5%FBS培養(yǎng)液將各組細(xì)胞制備成密度為2×105/mL的細(xì)胞懸液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，用甲醛固定后結(jié)晶紫染色，PBS漂洗后用棉簽擦去小室內(nèi)膜上的細(xì)胞，在顯微鏡下拍照記錄穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.4 各組細(xì)胞Wnt1和β-catenin蛋白的檢測采用Western blotting法。將A549細(xì)胞以4×105/mL接種于6孔板中，給予相應(yīng)藥物干預(yù)48 h后，用PIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗4℃過夜（一抗稀釋比例：Wnt1 1∶2 000，β-catenin 1∶1 000，βactin 1∶4 000），次日，孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（稀釋比例1∶6 000），1 h后采用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。應(yīng)用Image Lab軟件分析條帶灰度值并分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組A549細(xì)胞遷移、侵襲能力比較48 h后，Wnt1刺激細(xì)胞后，細(xì)胞的遷移能力加強(qiáng)；給予SFN干預(yù)后，細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制，見圖1。干預(yù)組、模型組、對照組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為（35.33±2.52）、（65.00±6.24）、（28.00±2.65）個，與對照組比較，模型組細(xì)胞遷移數(shù)量增多，與模型組比較，干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)量少（P均＜0.05）。Transwell侵襲實驗顯示，Wnt1刺激細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲能力加強(qiáng)；給予SFN干預(yù)后，細(xì)胞的侵襲能力明顯受到抑制，見圖2。SFN干預(yù)組、模型組、正常對照組、Wnt1和 細(xì) 胞 侵 襲 數(shù) 量 分 別 為（44.67±14.98）、（127.33±11.93）、（31.00±11.14）個，與對照組比較，模型組細(xì)胞侵襲數(shù)量增多，與模型組比較，干預(yù)組細(xì)胞侵襲數(shù)量減少（P均＜0.05）。

圖1 各組顯微鏡下遷移細(xì)胞（×200）

圖2 各組顯微鏡下侵襲細(xì)胞（×200）

2.2 各組Wnt1和β-catenin蛋白水平比較與對照組比較，模型組Wnt1、β-catenin蛋白水平升高；與模型組比較，干預(yù)組Wnt1、β-catenin蛋白水平降低（P均＜0.05）。各組Wnt1、β-catenin蛋白水平見表1。

表1 各組Wnt1、β-catenin蛋白水平（±s）

表1 各組Wnt1、β-catenin蛋白水平（±s）

組別對照組模型組干預(yù)組Wnt1 0.40±0.29 0.76±0.06 0.42±0.11 β-catenin 0.56±0.09 1.06±0.16 0.60±0.14

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤［9-10］，嚴(yán)重影響人們的健康和生存質(zhì)量，其中NSCLC中肺腺癌侵襲和遷移能力較強(qiáng)。尋找抑制肺腺癌侵襲遷移的靶點(diǎn)有助于為肺腺癌的防治提供思路。Wnt1因子是Wnt家族主要成員之一，有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt1蛋白在NSCLC中高表達(dá)，并且過表達(dá)Wnt1蛋白會導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞增殖、遷移增加［11-12］。

花椰菜提取物SFN具有抗炎抗氧化作用，是抗癌效果最好的植物活性物質(zhì)［13-14］。SFN可通過調(diào)控多種通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，降低腫瘤血管生成，抑制其遷移［15-16］；降低腫瘤預(yù)后復(fù)發(fā)率和疾病進(jìn)展［17］。最新研究發(fā)現(xiàn)，SFN可通過調(diào)控IL-6/ΔNp63α/Notch通路抑制煙草煙霧導(dǎo)致的肺癌干細(xì)胞增殖與浸潤遷移，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，起到預(yù)防和治療肺癌的作用［18］，但其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究中，我們通過MTT法篩選出SFN對A549細(xì)胞活性的抑制最佳濃度（20μmol/L）。應(yīng)用Wnt1因子刺激后，采用Western blotting法檢測Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)增加，激活Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使A549細(xì)胞侵襲遷移，與前期研究結(jié)果Wnt/βcatenin通路激活后可促進(jìn)肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肺癌的侵襲與遠(yuǎn)處遷移一致。同時，采用SFN干預(yù)后，二者表達(dá)減少，抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲遷移。結(jié)合細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗證實SFN對肺腺癌A549細(xì)胞侵襲遷移有抑制作用。

綜上所述，SFN對肺腺癌A549細(xì)胞侵襲遷移有抑制作用，其機(jī)制主要與阻止Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制有待今后的深入探索。本研究為新型藥物SFN應(yīng)用于肺癌治療提供研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)。后續(xù)研究我們將把SFN與多種肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡與細(xì)胞周期聯(lián)系起來，并通過敲低或過表達(dá)Wnt1或β-catenin，深入探討SFN與Wnt/β-catenin信號通路對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。