王莉，許文立，朱曉霞，段宇

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南京210029

近年，隨著工業(yè)化進程不斷推進，環(huán)境污染對人類健康已造成嚴重威脅。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（EEDs）是一類外源性化學物質，能夠干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)天然激素合成、分泌、轉運、結合、代謝等多個環(huán)節(jié)，對人體生長/發(fā)育、神經(jīng)、生殖及免疫系統(tǒng)等多臟器/多系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響［1］。多氯聯(lián)苯（PCBs）為EEDs的一種，因曾廣泛應用于電池、農(nóng)藥、塑化劑、建筑材料等的原料，在環(huán)境中普遍存在。PCBs具有垂直傳播、持久富集等特性，可通過食物鏈蓄積長期存在于動物和人體內(nèi)，又被稱為典型的“持續(xù)性有機污染物（POPs）”。環(huán)境中PCBs殘留能對人體神經(jīng)、免疫、心血管、生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴重危害［2-3］。在長三角地區(qū)，PCB118作為PCBs最具代表性的成員之一，常被用于衡量環(huán)境中總PCBs的重要指標［4］。

研究表明，PCBs可通過多種機制干擾下丘腦—垂體—甲狀腺軸，進一步損害甲狀腺結構及功能［5-6］。課題組前期體內(nèi)及體外研究顯示，PCB118可造成甲狀腺超微結構破環(huán)和自噬現(xiàn)象產(chǎn)生［7］。然而，潛在的觸發(fā)機制尚不清楚。Tubb3作為β-微管蛋白（β-tubulin）家族的重要成員，參與構成細胞骨架及細胞內(nèi)信號轉導［8］。另有研究表明，諾考達唑能誘導Tubulin與DAPK2-C端氨基酸結合并相互作用，由此激活DAPK2及其后續(xù)細胞自噬機制［9］。2018年9月—2020年6月，我們觀察了PCB118作用后大鼠甲狀腺組織的超微結構，檢測了自噬相關蛋白，并從Tubb3/DAPK2-自噬相關通路的角度探討其可能的分子機制，為進一步揭示PCB118造成甲狀腺超微結構損傷機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑及儀器40只雄性Wistar大鼠（6～8周齡，體質量280～300 g）購于北京Vital River公司，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學動物中心。動物均置于光照控制（12 h：12 h，明/暗周期交替）和溫度恒定（22±1）℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，可自由攝取食物及飲水。PCB118（純度100%；No.31508-00-6）（美國Ac‐cuStandard公司）。一抗包括GAPDH（2118S）、LC3（12741S）、BECLIN1（3495S）、P62（5114S）、Tubb3（5568S）、MRLC（8505S）、phospho-MRLC（p-MRLC，3671S）、ATG9A（13509S）抗體（美國CST公司）；DAPK2（NB100-56344）（美國Novus公司，均為兔抗）；二抗（Vector Laboratories，美國）；PCR引物（上海英俊公司）?？俁NA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）、逆轉錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix Kit、qRT-PCR試劑盒SYBR-Green kit（TaKaRa，日本）、全蛋白提取試劑盒（KGP250/KGP2100）（江蘇凱基生物公司）。StepOnePlus實時定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）、超薄切片儀（德國，Leica公司）、透射電子顯微鏡（美國，F(xiàn)EI Company）、組織勻漿儀（德國，IKA公司）、多功能酶標儀（美國，MJ Re‐search）、Real-time PCR儀（美 國，Applied Biosys‐tems）、蛋白電泳轉膜系統(tǒng)及凝膠成像儀（美國，Bio-Rad公司）。

1.2 Wistar大鼠分組及PCB118腹腔注射40只雄性Wistar大鼠隨機分為四組，分別為A、B、C、D組，予以每組大鼠腹腔注射對應劑量0、10、100、1 000 μg/（kg·d）PCB118，注射頻率為每周5次，共計13周。然后所有動物被處以安樂死，并分離甲狀腺組織，將甲狀腺組織固定于4%多聚甲醛或直接-80℃保存。

1.3 大鼠甲狀腺組織超微結構的觀察選取甲狀腺組織，切成0.5～1 mm3的小塊，浸入2.5%戊二醛進行前固定，后依次用1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗、1%鋨酸后固定樣品、PBS漂洗、丙酮梯度室溫脫水，然后挑出包埋劑滲透好的甲狀腺組織標本進行超薄切片、檸檬酸及鉛醋酸鈾雙重染色，最后置于透射電鏡下觀察并攝片記錄結果。

1.4 甲狀腺組織自噬相關蛋白及Tubb3/DAPK2-通路蛋白的檢測采用蛋白免疫印跡法。取出凍存于–80℃的甲狀腺組織樣本，每個樣本用分析天平稱取100 mg組織小塊，采用全蛋白提取試劑盒抽提組織總蛋白，用BCA法測樣品蛋白濃度，后加入對應體積5×loading buffer上樣緩沖液。SDS電泳、轉膜、5%BSA封閉，加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，二抗室溫孵育1 h，再次用TBST洗滌10 min×3次，最后ECM曝光顯影。用Image-J軟件（National In‐stitute of Health，美國）對蛋白條帶做定量分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，目標蛋白的相對表達量通過目標蛋白與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.5 甲狀腺組織Tubb3/DAPK2-通路相關基因的檢測采用實時定量PCR（qRT-PCR）法。從大鼠甲狀腺組織提取總RNA，然后用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA，最后通過SYBR-Green試劑盒在StepOnePlus系統(tǒng)上實時定量PCR。引物序列：β-ac‐tin上 游5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′，下 游5′-ATGCAGGGAT-GATGTTCTGG-3′；Tubb3上游5′-GTGACGAGCATGGCATAGAC-3′，下游5′-GGCCT‐GAATAGGTGTCCAAA-3′；DAPK2上游5′-CTTCCT‐GGGAGACACAAAGC-3′，下 游5′-GCTTCCGAAT‐GAAGTCCTTG-3′；NMMHC-ⅡA上游5′-ATCCTTT‐GCACGGGTGAGT-3′，下游5′-CAACGATGTAGCC‐GTTGACA-3′；ATG9A上 游5′-CTAGGGCTTCGA‐CATTGCAT-3′，下游5′-TTCCCGTTCAAATTCCCTTC-3′。以β-actin作內(nèi)參，目的基因表達量通過2-ΔΔCT法計算得出。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料用-x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用Sidak法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組超微結構的變化A組甲狀腺組織細胞核及濾泡腔結構完整，線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)等細胞器清晰可見（圖1a）。與A組比較，B、C、D組（圖1b～d）甲狀腺濾泡細胞損傷、部分空泡化，線粒體密度下降、嵴膜消失，伴內(nèi)質網(wǎng)擴張，且上述改變在C組最為明顯。B組未見典型自噬小體（圖1b），而C組自噬小體數(shù)量明顯增加（圖1c），D組自噬小體數(shù)量顯著增加（圖1d）。

圖1 各組甲狀腺組織超微結構

2.2 各組甲狀腺組織自噬相關蛋白LC3、BE‐CLIN1、P62水平的比較與A組比較，B組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高（P均＜0.05）；C、D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BE‐CLIN1蛋白表達升高，P62蛋白表達降低（P均＜0.01）。與B組比較，C組BECLIN1蛋白表達升高（P均＜0.01）；D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表達升高，P62蛋白表達降低（P均＜0.05）。與C組比較，D組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BECLIN1蛋白表達升高（P均＜0.01）。各組甲狀腺組織自噬相關蛋白LC3、BE‐CLIN1、P62水平見表1。

2.3 各組甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、MRLC、p-MRLC、ATG9A蛋白水平比較與A組比較，C、D組Tubb3蛋白表達降低（P均＜0.01），DAPK2蛋白表達、p-MRLC/MRLC升高（P均＜0.05）。與B組比較，C組Tubb3蛋白表達降低，DAPK2蛋白表達升高（P均＜0.05）；D組Tubb3蛋 白 表 達 降 低，DAPK2、MRLC、p-MRLC蛋 白 表 達 及p-MRLC/MRLC升高（P均＜0.05）。與C組比較，D組DAPK2蛋白表達降低，MRLC、p-MRLC蛋白表達及p-MRLC/MRLC升高（P均＜0.05）。各組甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、MRLC、p-MRLC、ATG9A蛋白水平見表2。

表1 各組甲狀腺組織自噬相關蛋白LC3、BECLIN1、P62水平（-x±s）

表2 各組大鼠甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、MRLC、p-MRLC、ATG9A蛋白水平（-x±s）

2.4 各組甲狀腺組織Tubb3、DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA比較與A組比較，B組Tubb3 mRNA降低，DAPK2、ATG9A mRNA升高（P均＜0.05）；C組Tubb3 mRNA降低，DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9 A mRNA升高（P均＜0.05）；D組Tubb3表達降低，NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA升高（P均＜0.05）。與B組 比 較，C組DAPK2、ATG9A mRNA升 高（P均＜0.01）。與C組比較，D組DAPK2、ATG9A mRNA降低（P均＜0.05）。各 組 甲 狀腺 組 織Tubb3、DAPK2、NMMHC-ⅡA、ATG9A mRNA水平見表3。

表3 各組甲狀腺組織Tubb3 DAPK2，NMMHC-ⅡA，ATG9A mRNA水平（-x±s）

3 討論

在持續(xù)性環(huán)境有機污染物中，PCBs因其毒性效應而被廣泛研究。PCBs可造成機體多系統(tǒng)、多組織、多器官損害［9-10］，其中甲狀腺是PCBs作用于內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要靶器官［11］。相關研究表明，PCBs可影響甲狀腺激素合成、分泌、運輸、代謝等方面，造成甲狀腺功能障礙［12］。PCB118作為PCBs具有代表性的成員之一，已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于長江三角洲地區(qū)的水生生物體內(nèi)，甚至蓄積在人體的乳汁及組織中［13-14］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性低劑量PCB118可造成大鼠甲狀腺組織增生肥大、炎癥浸潤及間質纖維化［6］，但目前關于PCB118暴露是否影響甲狀腺超微結構尚不明確。

我們通過透射電子顯微鏡觀察到甲狀腺超微結構毀損，出現(xiàn)線粒體腫脹、濾泡細胞擴張伴部分空泡化；還發(fā)現(xiàn)溶酶體增多、粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張等亞結構改變，上述變化與ZHOU等［7］研究結果一致。此外，本研究在暴露于100 μg/（kg·d）及1 000 μg/（kg·d）PCB118劑量的甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)典型雙層膜結構的自噬小體，呈現(xiàn)一定的劑量相關性，即隨PCB118濃度升高自噬反應逐漸增強，表明低濃度PCB118可誘導大鼠甲狀腺發(fā)生自噬反應，且甲狀腺超微結構損傷與細胞自噬可能存在密切關系，但精確機制尚不完全清晰。

自噬是一種保守的降解代謝/循環(huán)過程，在維持細胞自我更新及細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用［15］。細胞自噬可通過多種信號通路調(diào)節(jié)介導，從而促進膜內(nèi)陷和自噬囊泡的形成［16］。在自噬效應的發(fā)生過程中，存在3種與自噬密切相關的蛋白標志物，分別為與自噬效應呈正相關的LC3及BECLIN1和負相關的P62。其中LC3Ⅰ到LC3Ⅱ的轉化反映了自噬發(fā)生的活性；BECLIN1通過與VPS34相互作用，主要參與調(diào)控自噬體的形成與成熟［17-18］。在本研究中，PCB118暴露組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與BE‐CLIN1蛋白表達呈劑量依賴性增加效應，在PCB118最大劑量［1 000μg/（kg·d）］時，大鼠甲狀腺組織自噬現(xiàn)象最明顯。另外，作為一種多功能蛋白，P62通過多泛素化蛋白參與自噬機制，由此調(diào)節(jié)自噬流和自噬溶酶體活性，P62蛋白降解即反映自噬體與溶酶體的融合降解，被用作最終決定自噬效應完成的有效標志蛋白［19］。本研究結果顯示，P62蛋白表達水平隨PCB118劑量升高呈劑量依賴性減少趨勢，在PCB118劑量為1 000μg/（kg·d）時達到最低表達量。這些結果表明PCB118以劑量依賴性方式誘導大鼠甲狀腺自噬現(xiàn)象發(fā)生。

Tubb3作為β-tubulin家族的重要成員，受細胞內(nèi)外多種因素調(diào)節(jié)，其表達異?？梢鸾M織或細胞形態(tài)改變，誘發(fā)細胞解體甚至死亡［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，PCB118暴露使得甲狀腺組織Tubb3基因及蛋白表達下調(diào)，表明PCB118能夠引起微管蛋白改變，進而可能損傷到細胞骨架系統(tǒng)，上述結果與WANG等［21］的研究相一致。亦有研究證實，Stathmi、秋水仙堿等抗微管蛋白因子可通過修飾微管蛋白二聚體，干擾其家族基因和蛋白表達，進而導致微管動力學、細胞骨架及結構改變［22-23］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)微管蛋白Tubb3的改變與PCB118引起的甲狀腺超微結構損傷具有一致性，提示Tubb3異常表達可能在PCB118誘導甲狀腺自噬過程中發(fā)揮重要作用。

DAPK2屬于絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶家族成員，能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各類細胞活動，如炎癥、凋亡、自噬及質膜起泡等［24］。近年來，DAPK2被認為是細胞自噬的關鍵調(diào)控因子，其定位于自噬囊泡內(nèi)膜，參與構成自噬小體［25］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PCB118能夠促進大鼠甲狀腺組織DAPK2基因及蛋白表達上調(diào)。本課題組前期采用細胞實驗證實Tubb3位于DAPK2上游，其可與DAPK2相互結合，由此激活DAPK2及其后續(xù)細胞自噬機制［7］。由此推測，慢性低濃度PCB118可能誘導Tubb3表達異常，進一步結合并激活DAPK2，促進后續(xù)自噬反應發(fā)生。

已有研究證實，MRLC是DAPK2的重要底物之一［24］。非肌肉肌球蛋白Ⅱ（以下簡稱“肌球蛋白Ⅱ”）是一種以肌動蛋白為基礎的運動蛋白，在結構上具有兩個肌球蛋白重鏈（NMMHC-Ⅱ）、兩個必需輕鏈及兩個調(diào)節(jié)性輕鏈（MRLC）。在脊椎動物中NMMHC-Ⅱ具有3種亞型，分別為NMMHC-ⅡA、-ⅡB、-ⅡC，并且在不同組織中表達各不相同［26］。在哺乳動物甲狀腺中，NMMHC-ⅡA可作為肌球蛋白Ⅱ的編碼基因；而肌球蛋白Ⅱ的激活/活化通過MRLC Ser19磷酸化實現(xiàn)［27］。相關研究表明，在缺氧、營養(yǎng)剝奪等應激條件下，DAPK2通過磷酸化底物MRLC激活肌球蛋白Ⅱ，隨后MRLC的磷酸化可進一步作用并激活ATG9A，參與啟動細胞自噬，促進自噬小體形成［24，28］。甲狀腺組織ATG9A mRNA及蛋白表達隨MRLC的磷酸化/活化而升高。本研究中，我們檢測暴露于PCB118后NMMHC-ⅡA、ATG9A表達及MRLC磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)甲狀腺組織MRLC磷酸化與ATG9A mRNA及蛋白表達變化一致，提示ATG9A可能隨MRLC的磷酸化/活化而升高。WANG等［21］通過慢病毒過表達Tubb3及小干擾RNA實驗發(fā)現(xiàn)，PCB118可通過Tubb3/DAPK2/MRLC/ATG9A通路介導甲狀腺FRTL-5細胞自噬反應。本研究在前述研究基礎上通過動物體內(nèi)實驗進一步證實，PCB118可能同樣誘導甲狀腺組織主要發(fā)生以下系列級聯(lián)反應，即異常表達的Tubb3結合并激活DAPK2，促進MRLC磷酸化和ATG9A表達，進而啟動自噬反應。

綜上所述，自噬在慢性低濃度［0～1 000 μg/（kg·d）］PCB118導致大鼠甲狀腺組織損傷中起重要作用，其作用機制可能與Tubb3/DAPK2-相關信號通路有關。然而PCBs誘導甲狀腺自噬的作用機制復雜，可能涉及其他信號途徑，具體機制仍需進一步深入研究。