卡思木江·阿西木江，庫爾班乃木·卡合曼，希林古麗·吾守爾，吳桂霞，許晨波，庫熱西·玉努斯

1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，烏魯木齊830017；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室；4新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室；5新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種難治性非特異性腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸?。↖BD）的一個亞類［1-2］，UC是以腸黏膜或黏膜下持續(xù)發(fā)炎為主要特征，腹痛、腹瀉、體質(zhì)量減輕、腸道出血和便血等為主要癥狀［3］。UC的發(fā)病率近年來在全球呈上升趨勢，尤其在過去幾十年中，發(fā)展中國家的發(fā)病率迅速上升［4-7］。宿主的免疫應(yīng)答在UC的發(fā)生、發(fā)展和延續(xù)過程中起著重要作用。免疫耐受的喪失會引起促炎因子和抗炎因子間的平衡失調(diào)，尤其是各種促炎介質(zhì)的增加而引起局部和全身性炎癥［8-9］。T淋巴細(xì)胞（簡稱T細(xì)胞）是參與免疫—炎癥反應(yīng)的主要免疫細(xì)胞，T細(xì)胞的分化紊亂導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的失衡，從而導(dǎo)致炎癥［10］。先前的研究表明，CD4+T細(xì)胞的亞群Th1和Th2細(xì)胞的平衡在UC的發(fā)生中起關(guān)鍵作用［11-12］，近期研究認(rèn)為，產(chǎn)生IL-17的Th17型細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）均在UC的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［13-14］。腸道黏膜的局部炎癥可促進(jìn)T細(xì)胞活化，活化的T細(xì)胞可能攻擊UC患者腸道黏膜中的靶標(biāo)，導(dǎo)致組織破裂并進(jìn)一步加重炎癥的發(fā)生，產(chǎn)生惡性循環(huán)［15］。因此調(diào)控T細(xì)胞亞群失衡可能在預(yù)防和治療UC過程中具有重要的意義。2018年6月—2020年6月，本研究在TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC模型的基礎(chǔ)上，用復(fù)方緩潰樂混懸劑（HKL）和嗜酸乳桿菌（Lac）對大鼠UC進(jìn)行灌胃干預(yù)，觀察Lac與HKL灌胃對UC大鼠損傷腸黏膜的修復(fù)作用；用流式細(xì)胞術(shù)檢測UC大鼠和各干預(yù)組大鼠腹主動脈血T細(xì)胞亞群的變化來分析干預(yù)治療對大鼠免疫功能的影響，以探討HKL、Lac干預(yù)對UC大鼠損傷腸黏膜修復(fù)作用的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、藥物、試劑、儀器SPF級雄性Wi‐star大鼠，體質(zhì)量（200±20）g（由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），晝夜節(jié)律12 h/12 h，每籠5只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，整個實(shí)驗(yàn)過程中所有大鼠的飼養(yǎng)條件保持一致，保持室內(nèi)溫度（25±3）℃，相對濕度60%～80%，自由飲食水。凍干型乳酸菌粉-Lac（簡稱Lac），檢驗(yàn)合格證號：JYS-2019350，批號：190703，檢驗(yàn)依據(jù)：Q/ZKJY0001S；乳酸菌活菌總數(shù)=1.44×1010cfu/g，大腸桿菌MPN/g符合規(guī)定，水分5.7 %。菌種組成：Lac；載體：低聚異麥芽糖）；HKL［稱取不同重量的黃連、石榴花、琥珀、沒食子、天竺黃、赤石脂、拳參、血竭、溫桲子、車前草子分別粉碎后過100目篩，將溫桲子（8 g）與車前草子（15 g）混合后至于70 mL玫瑰花露中浸提6 h（溫度80～90℃），過濾后收集濾液，每2 mL濾液中添加0.36 g按比例混合的琥珀、天竺黃、石榴花、赤石脂、黃連、拳參、沒食子、血竭，充分混勻，即制備得到治療UC的中藥組合物。給藥劑量為1.8 g/kg（藥物制備工藝已申請專利，專利號：201810790421.7）］。TNBS購自Sigma公司；乙醇、DXflex流式細(xì)胞儀（貝克曼）；EDTA真空抗凝采血管；紅細(xì)胞裂解液（BD公司）；CD3、CD4、CD8抗體（BD公司）；CD4、CD25表面抗體；磷酸鹽（PBS）緩沖溶液（pH 7.2～7.4）；TF Fix/Perm Work‐ing Solution（BD公司）；Perm/Wash Working Solution（BD公司）；流式細(xì)胞術(shù)抗體（BD Biosciences）；細(xì)胞核流式抗體Foxp3（BD公司）。低溫離心機(jī)（PPendorf）。

1.2 大鼠分組、UC模型的建立及Lac、HKL灌胃方法按完全隨機(jī)法將90只大鼠分為正常組（n=10）和TNBS造模組（n=80）。參照MORRIS等［16］的方法制作TNBS/乙醇誘導(dǎo)的大鼠UC模型，具體方法如下：將大鼠禁食24 h后麻醉，5 %的TNBS溶入等體積50%的無水乙醇后，利用石蠟潤滑的內(nèi)徑1.5 mm的硅膠灌緩慢注入保持仰臥姿勢的造模組大鼠結(jié)腸內(nèi)（離肛門約8 cm處），注入完成后，輕輕拔出硅膠管并立即捏緊肛門使大鼠呈倒立姿勢保持1 min左右，以保證TNBS/乙醇混合液能充分吸收后將大鼠放入干凈的鼠籠內(nèi)，正常組大鼠注入相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液灌腸，造模結(jié)束后將大鼠放入清潔籠內(nèi)，待其自行清醒，自由飲水。造模后第2天觀察大鼠的一般精神狀態(tài)，并檢測體質(zhì)量，然后分別從正常組和TNBS造模組隨機(jī)挑選2只大鼠，取結(jié)腸組織做病理切片，電子顯微鏡下見潰瘍形成，證實(shí)結(jié)腸炎形成。再將TNBS造模組隨機(jī)分為4組：UC組、Lac組、HKL組、LH組（0.21 g/kg Lac+1.8 g/kg HKL）。建立UC模型后正常飼養(yǎng)，隨機(jī)飲水，造模第3天開始用普通鼠飼料飼養(yǎng)；正常組和UC組給予等量的蒸餾水，Lac組灌胃0.21 g/kg的Lac，HKL組 灌 胃1.8 g/kg HKL，LH組 大 鼠 灌 胃0.21 g/kg的Lac，0.5～1 h后再灌胃1.8 g/kg HKL，均每日2次，連續(xù)14 d。

1.3 結(jié)腸組織組織病理學(xué)檢查干預(yù)結(jié)束后將大鼠麻醉，分離取出距離肛門8 cm處的結(jié)腸組織，沿腸系膜縱形剪開腸腔，用預(yù)冷好的生理鹽水迅速沖洗干凈，吸干水分，展平觀察，并將組織縱切成兩半，經(jīng)固定、脫水、包埋、取4 μm組織切片，進(jìn)行HE染色，參照AUTENRIETH等［17］的組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，由病理科專業(yè)人員盲法閱片，評分為4個等級，評分越高，表明黏膜損傷及炎癥程度越高。

1.4 大鼠腹主動脈血中T細(xì)胞亞群的檢測用EDTA真空抗凝采血管抽取大鼠腹主動脈血1～2 mL，靜置20 min后用流式細(xì)胞術(shù)檢測。①細(xì)胞表面染色法檢測T淋巴細(xì)胞亞群：100μL抗凝全血中分別加入5 mL的CD3、CD4、CD8抗體，孵育；裂解紅細(xì)胞后用PBS洗滌并離心，棄上清；重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測。②胞內(nèi)染色法檢測Th1/Th2/Th17細(xì)胞比例。刺激細(xì)胞活化后加CD4表面抗體；裂解紅細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞固定和破膜；胞內(nèi)染色，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。③細(xì)胞核內(nèi)染色法檢測Treg淋巴細(xì)胞比例。100μL全血中分別加入5 mL CD4、CD25表面抗體，孵育；裂解紅細(xì)胞后用PBS洗滌并離心，棄上清；細(xì)胞固定和破膜后清洗，離心，棄上清；加抗體Foxp3，孵育，棄上清，重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進(jìn)一步比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)、大體、組織病理學(xué)觀察結(jié)果與正常組相比，UC組造模后第2天起出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡、活動量減少等現(xiàn)象，大部分大鼠出現(xiàn)稀便、黏液膿血便，體質(zhì)逐漸變得虛弱、體質(zhì)量下降。正常組、UC組、HKL組、Lac組、LH組初始體質(zhì)量分別為（226.4±12.6）、（228.4±19.5）、（232.5±8.4）、（227.9±13.2）、（230.4±20.6）kg；治療第14天的體質(zhì)量分別為（283.2±15.7）、（236.1±24.0）、（268.0±17.9、（260.4±13.4）、（274.0±20.7）kg。干預(yù)結(jié)束時，與正常組相比，UC組大鼠體質(zhì)量降低（P均＜0.01）；與UC組相比，干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均增加，其中LH組和HKL組大鼠體質(zhì)量增加最明顯（P均＜0.01）。

大體標(biāo)本觀察結(jié)果：UC組大鼠結(jié)腸表現(xiàn)為凹凸不平、結(jié)腸明顯縮短、異常變大、病變部位腸壁增厚、壞死水腫，部分大鼠結(jié)腸顏色發(fā)黑、有糜爛與腸粘連、管壁僵硬，病變壞死區(qū)域平均2 cm左右。Lac組大鼠的結(jié)腸損傷程度有改善，有輕度至中度水腫，個別大鼠腸壁有糜爛、增厚現(xiàn)象，部分組織有小出血點(diǎn)。LH組和HKL組部分大鼠結(jié)腸表面有輕度水腫、少數(shù)有充血、腸壁增厚已有明顯改善，結(jié)腸組織損傷改善比較明顯，其中LH組大鼠損傷減輕程度最為明顯，見圖1。

組織病理學(xué)觀察結(jié)果：LH組、Lac組、HKL組、UC組及正常組組織損傷程度評分分別為（1.17±0.71）、（1.79±1.02）、（1.29±0.70）、（2.56±0.66）、（0.08±0.24）分，與正常組比較，UC組組織損傷程度評分升高，與UC組比較，HKL組、LH組組織損傷程度評分降低（P均＜0.01）。

2.2 各組大鼠腹主動脈血T細(xì)胞亞群比較與正常組相比，UC組大鼠大鼠腹主動脈血中CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比均下降（P＜0.05），CD4/CD8比例降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。與UC組相比，LH組和HKL組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞比例上升（P均＜0.05）；與UC組相比，各干預(yù)組CD8+T細(xì)胞百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化（P均＞0.05），Lac組、UC組CD4+T細(xì)胞，CD3+T細(xì)胞比例比較，P均＞0.05，見表1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織肉眼觀察所見

表1 各組大鼠腹主動脈血T淋巴細(xì)胞亞群（±s）

表1 各組大鼠腹主動脈血T淋巴細(xì)胞亞群（±s）

組別LH組HKL組Lac組UC組正常組n 6 6 6 6 6 CD3+44.02±1.86 49.89±5.40 39.33±6.78 35.09±5.71 56.04±6.35 CD3+CD4+35.32±3.65 36.20±4.11 28.95±3.51 27.75±6.31 39.08±5.71 CD3+CD8+14.17±1.79 15.93±2.61 14.17±4.91 14.57±2.09 19.60±4.28 CD4+/CD8+2.39±0.33 2.34±0.59 2.20±0.58 1.89±0.23 2.08±0.61

Th1細(xì)胞比例：與正常組比較，UC組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LH組、HKL組和Lac組較UC組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。Th2細(xì)胞比例：UC組比正常組升高（P＜0.05），LH組、HKL組和Lac組較UC組降低（P＜0.05）。Treg細(xì)胞比例：UC組較正常組降低，但HKL組、Lac組和LH組較UC組升高（P＜0.05）。Th17細(xì)胞的比例：UC組比正常組升高（P＜0.05），各干預(yù)組比UC組降低（P＜0.05）。各組大鼠腹主動脈血Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞百分比見表2。

表2 各組大鼠腹主動脈血Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞百分比（±s）

表2 各組大鼠腹主動脈血Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞百分比（±s）

組別LH組HKL組Lac組UC組正常組n 6 6 6 6 6 Th1細(xì)胞1.21±1.06 1.30±0.70 1.33±1.03 2.11±1.79 1.12±0.40 Th2細(xì)胞2.85±1.26 1.94±0.35 2.31±31.12 6.97±3.57 3.22±1.70 Treg細(xì)胞4.84±1.43 5.94±0.86 3.68±0.84 1.75±1.32 4.89±1.25 Th17細(xì)胞1.16±0.23 1.05±0.20 2.02±1.44 4.02±0.96 1.74±0.71

3 討論

中藥被廣泛用于UC的治療［18］，由黃蓮、車前草子、石榴花、沒食子等十種中藥材所組成的中藥組合物HKL對大鼠UC具有一定的治療效果［19］。由于UC發(fā)病過程中腸黏膜屏障破壞和免疫系統(tǒng)異常激活均與腸道菌群失衡有關(guān)，因此除了需要基于調(diào)節(jié)免疫的治療外，輔助應(yīng)用微生態(tài)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)腸道菌群失衡也尤為重要［20］。Lac作為一種十分重要的益生菌，其自身代謝產(chǎn)物能夠抑制病原微生物生長［21-22］。LEE等［23］在研究Lac對結(jié)腸炎的治療效果時發(fā)現(xiàn)，Lac可以降低TLR的表達(dá)，降低腸道炎癥反應(yīng)，Lac能夠使TLRs表達(dá)、腸道菌群平衡及宿主健康三者之間處于最佳平衡狀態(tài)。研究報(bào)道顯示，治療UC過程中益生菌與傳統(tǒng)治療藥物聯(lián)合使用時對UC的治療效果更為明顯［24］。因此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上假設(shè)益生菌和復(fù)方中藥的有效組合可能提高治療UC的效率。本研究通過大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Lac雖然對大鼠結(jié)腸組織損傷具有一定的修復(fù)作用，但炎細(xì)胞浸潤程度比較重，炎細(xì)胞浸潤深度也覆蓋結(jié)腸全層，對大鼠UC的修復(fù)作用明顯低于LH組和HKL組，在結(jié)腸組織病理學(xué)、體質(zhì)量和一般狀態(tài)等方面比較，聯(lián)合干預(yù)對UC大鼠的治療作用較為明顯，說明中藥HKL聯(lián)合Lac會提升單種藥物對UC的治療效果，具體作用機(jī)制有待于研究。

關(guān)于血液淋巴細(xì)胞亞群的研究表明，IBD中高度加劇的慢性炎癥與外周血T細(xì)胞活化增加有關(guān)，這表明局部腸道炎癥可能會刺激全系統(tǒng)的適應(yīng)性免疫 反 應(yīng)［25］。T細(xì) 胞 根 據(jù)CD分 子 的 表 達(dá) 分 類 為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，其中CD4+T的主要亞群是輔助性T細(xì)胞（Th），活化后主要通過分泌各種細(xì)胞因子輔助細(xì)胞免疫和體液免疫。CD8+T細(xì)胞主要是一類具有殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞，稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，發(fā)揮抑制細(xì)胞及體液免疫的作用。這兩種細(xì)胞的失衡與UC等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［26］。本研究中通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組腹主動脈血中T淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示UC組大鼠CD3+、CD4+均明顯下降，說明UC大鼠免疫力下降，同時CD4+/CD8+下降，說明UC大鼠的細(xì)胞免疫功能處于相對免疫抑制狀態(tài)，機(jī)體對被病毒感染的靶細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的突變細(xì)胞的識別和殺傷能力下降。CD8+T細(xì)胞數(shù)量在UC活動期時較正常人或者緩解期患者顯著減少。UC大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)后，CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+均上升，Lac與HKL聯(lián)合干預(yù)后，UC大鼠的免疫功能逐漸恢復(fù)，說明Lac與HKL的聯(lián)合影響UC大鼠的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，改變原始T細(xì)胞的活化方向和程度。

Th細(xì)胞充當(dāng)免疫應(yīng)答的輔助或誘導(dǎo)劑。在正常情況下，體內(nèi)的Th1和Th2細(xì)胞處于動態(tài)平衡并相互調(diào)節(jié)，從而維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。如果Th1和Th2細(xì)胞失去平衡，則炎癥會在組織和器官中發(fā)生并引起疾病。Th1和Th2細(xì)胞均由Th0細(xì)胞的分化而產(chǎn)生，IL-12及IFN-γ誘導(dǎo)Th0向Th1細(xì)胞分化，IL-4誘導(dǎo)Th0向Th2分化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，UC組大鼠Th2細(xì)胞的比例升高，Th1細(xì)胞有上升趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與晁康等［26-27］研究結(jié)果一致，提示可能Th2細(xì)胞在UC的發(fā)生發(fā)展中起著主要作用。

研究顯示，UC發(fā)病的關(guān)鍵因素是促炎細(xì)胞因子的高分泌和IL-23/Th17軸的異常激活［28］。Th17細(xì)胞是不同于Th1和Th2細(xì)胞的Th細(xì)胞亞群，其作為免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，通過產(chǎn)生IL-17等促炎細(xì)胞因子依次誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞向感染部位遷移，引起炎癥反應(yīng)［29-31］。而Treg細(xì)胞通過調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的活性來協(xié)調(diào)整體免疫反應(yīng)，在防止UC惡化中起重要作用，通過分泌和調(diào)節(jié)抗炎細(xì)胞因子來抑制炎癥反應(yīng)的級聯(lián)并維持腸道免疫反應(yīng)的平衡［32-33］。研究表明，這兩種細(xì)胞形成了一種免疫平衡，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)作［34］。本研究中，UC組大鼠腹主動脈血Treg細(xì)胞比例較正常組明顯降低，Th17細(xì)胞比例明顯增加，而Treg/Th17降低，與SU等［34］研究結(jié)果一致。本研究中UC大鼠Th17和Treg細(xì)胞的平衡紊亂，說明局部炎癥不僅與結(jié)腸局部免疫有關(guān)，很有可能會引起全身免疫功能紊亂。在疾病緩解期間，血液中的CD4+CD25high和FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有所增加，但在疾病活動期卻有所減少［35］，說明機(jī)體免疫反應(yīng)跟疾病的階段有一定關(guān)系，本研究中Treg細(xì)胞減少說明UC大鼠可能處于疾病活動期。UC大鼠藥物干預(yù)后，各干預(yù)組大鼠腹主動脈血中的Treg細(xì)胞百分比均有不同程度的增加，Th17細(xì)胞百分比也均存在不同程度的下降，說明本研究中的各干預(yù)措施對UC大鼠產(chǎn)生的Treg/Th17平衡紊亂具有不同程度的調(diào)控作用。三種干預(yù)措施中，聯(lián)合干預(yù)調(diào)節(jié)Treg水平最接近于一般生理狀態(tài)，并且Treg/Th17的比例最接近于正常組水平，說明Lac和HKL的聯(lián)合可通過抑制UC大鼠Th17細(xì)胞的分化和促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化來調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡，Lac和HKL對UC干預(yù)的效果優(yōu)于其他單用藥物。

綜上所述，HKL對UC大鼠腸黏膜損傷的修復(fù)作用優(yōu)于Lac，Lac聯(lián)合HKL的修復(fù)作用最佳；Lac與HKL可能通過抑制血液中Th17細(xì)胞的分化、促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化而起作用。