邵毅，沈藝，牛琛，阮曉莉，Rena Nakyeyune，劉芬

首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 北京市臨床流行病學重點實驗室，北京100069

食管癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一［1］。中國是食管癌的高發(fā)區(qū)，根據(jù)國家癌癥中心最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國食管癌居全國惡性腫瘤發(fā)病第六位，死亡第四位［2］，其中食管鱗癌（ESCC）占我國食管癌病例的近90%［3］。ESCC早期癥狀隱匿，因吞咽困難等典型癥狀而就診的多數(shù)患者已進展至中晚期，外科手術(shù)和放化療的治療效果并不理想，我國ESCC患者的5年生存率不足30%［4］，是高致死性的疾病。因此，研究其發(fā)病機理，尋找早期診斷、治療及預后相關靶點是亟待解決的問題。

微小RNA（miRNAs）是一類小的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，并參與多種生物學過程，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后中發(fā)揮重要作用［5］。人類miRNAs具有成簇聚集在染色體上的特征，形成miRNA基因簇。其中，miR-17-92基因簇是最有特點的多順反子miRNA［6-7］，其位于C13orf25基因的第3內(nèi)含子中，可編碼為6個成熟的miR‐NAs，即miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-19b-3p和miR-92a-3p［8］。最 近 研 究 表明，miR-17-92基因簇在肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等實體腫瘤以及B細胞淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤中存在差異表達［9-11］。同時也有研究報道，miR-17-92基因簇在食管癌中存在異常表達的現(xiàn)象［12-15］，但與之相關的調(diào)節(jié)途徑及作用機制鮮有報道。因此，深入對miR-17-92基因簇的探究可能為惡性腫瘤研究提供新的思路，以期為癌癥診斷、治療及預后識別出具有潛在價值的標志物或新靶點。

本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Ge‐nome Atlas，TCGA）及基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）篩選ESCC組織中差異的miR-17-92基因簇成員，并對其靶基因進行預測及生物學功能分析，探討表達差異的miR-17-92基因簇成員及其靶基因與患者臨床病理特征、預后的關系，以期為識別ESCC分子標志物及明確分子發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源通過UCSC Xena網(wǎng)站（http：//xe‐na.ucsc.edu/）下載TCGA數(shù)據(jù)庫中94例ESCC樣本的miRNA、基因表達數(shù)據(jù)及其臨床信息，同時下載12例正常食管樣本的miRNA及基因表達數(shù)據(jù)。于GEO數(shù)據(jù)庫下載ESCC miRNA表達譜數(shù)據(jù)集GSE43732，該數(shù)據(jù)集包含119對ESCC及癌旁正常食管組織樣本，下載Agilent-038166 cbc_hu‐man_miR18.0平臺及矩陣數(shù)據(jù)文件。

1.2 ESCC組織、正常食管組織、癌旁組織中miR-17-92基因簇差異表達分析應用R軟件edgeR包分析TCGA數(shù)據(jù)庫中ESCC和正常食管組織間miR-17-92基因簇差異表達情況。選用GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析GSE43732數(shù)據(jù)集中ESCC和癌旁組織中miR-17-92基因簇差異表達情況。將ESCC組織、正常食管組織及癌旁組織中差異表達（差異倍數(shù)［fold change，F(xiàn)C］＞2倍，校正后P＜0.05）的miR-17-92基因簇成員作為關鍵miR‐NAs，聯(lián)合pheatmap包進行可視化，繪制熱圖。

1.3 食管癌組織差異表達miR-17-92基因簇的靶基因篩選及功能分析采用miRDB 6.0（http：//mirdb.org）、TargetScan 7.2（http：//www.targetscan.org）及miRTarBase 8.0（http：//mirtar‐base.cuhk.edu.cn）在線網(wǎng)站預測1.2中篩選所得關鍵miRNAs的靶基因，預測結(jié)果通過VennDiagram包取交集得到目標靶基因，并繪制韋恩圖。使用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），對目標靶基因進行蛋白互作網(wǎng)絡（PPI network）分析，并選擇置信分數(shù)＞0.9的相互作用靶基因進行后續(xù)研究。基于TCGA數(shù)據(jù)庫中基因表達數(shù)據(jù)對上述相互作用靶基因在ESCC中的表達情況進行分析，選擇其中差異表達（P＜0.05）的靶基因作為關鍵靶基因。利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https//david.ncifcrf.gov/）對關鍵靶基因進行基因本體（GO）功能富集分析。GO富集分析包括生物過程（Biological Process）、細胞組成（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）三個部分。利用KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）對關鍵靶基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。

1.4 關鍵miRNAs及其關鍵靶基因與ESCC患者臨床病理學特征、預后的相關性分析基于TCGA數(shù)據(jù)庫中ESCC樣本數(shù)據(jù)，對關鍵miRNAs及其關鍵靶基因與ESCC患者臨床病理學特征及預后的關系進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0及R軟件（4.0.2版）。兩組獨立樣本的比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。采用中位數(shù)法對每個miR‐NA及靶基因的表達水平進行分組，低于中位數(shù)為低表達組，高于中位數(shù)為高表達組?；趕urvival包及survminer包，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中表達差異的miR-17-92基因簇以FC＞2、校正后P＜0.05為閾值，ESCC組織和正常食管組織間miR-17-92基因簇中miR-17-5p和miR-18a-5p呈現(xiàn)差異表達，在ESCC中表達水平上調(diào)。ESCC組織及其癌旁組織間miR-17-92基因簇中miR-17-5p和miR-18a-5p同樣存在差異表達，在ESCC組織中表達水平上調(diào)。此外，miR-19a-3p、miR-20a-5p、miR-19b-3p及miR-92a-3p在ESCC組織中均呈現(xiàn)高表達趨勢。

2.2 關鍵miRNAs的靶基因本研究選擇miR-17-92基因簇中最具差異表達的miR-17-5p和miR-18a-5p作為關鍵miRNAs，對其靶基因進行預測及篩選。miR-17-5p潛在靶向調(diào)控基因有67個，miR-18a-5p潛在靶向調(diào)控基因有38個（圖1a）。進一步對上述靶基因進行PPI網(wǎng)絡分析，最終鑒定出28個互相作用靶基因及其44個互相作用關系（圖1b）?；赥CGA數(shù)據(jù)庫中基因表達數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，28個互相作用靶基因中有14個靶基因（CNOT6L、CTDSPL、ATM、FBXL5、NHLRC3、FEM1C、HIF1A、UBE2G1、CENPQ、CNOT7、RHOC、NR3C1、RUNX1、E2F3）在ESCC組織和正常食管組織間呈現(xiàn)差異表達（P均＜0.05），被確定為關鍵靶基因。這14個差異表達的關鍵靶基因可能在ESCC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

圖1 關鍵miRNAs的靶基因預測、篩選分析圖

2.3 關鍵靶基因的生物學功能對上述14個關鍵靶基因的KEGG信號通路及GO功能富集分析結(jié)果表明，關鍵靶基因主要參與的生物學過程為信號傳導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)控細胞增殖等；主要參與的細胞組成為細胞質(zhì)、細胞核等；主要參與的分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等。關鍵靶基因主要富集在“Pathways in cancer”，“Cell cycle”，“Transcription‐al misregulation in cancer”和“MicroRNAs in cancer”等腫瘤相關通路。

2.4 miR-17-5p和miR-18a-5p及其關鍵靶基因與ESCC患者臨床病理學特征、預后的關系miR-17-5p和miR-18a-5p在不同ESCC分化程度間存在差異表達，即相比于低分化（G3）ESCC患者，miR-17-5p（FC=1.47，P=0.02）和miR-18a-5p（FC=1.58，P=0.04）的表達水平在高—中分化（G1/G2）患者中更高。關鍵靶基因CTDSPL在ESCC不同分化程度間（G3與G1/G2相比）存在差異表達（FC=1.12，P＜0.01）；關鍵靶基因ATM（FC=1.18，P=0.01）和NHL‐RC3（FC=1.09，P=0.03）在ESCC不同T分期間（T3/T4與T1/T2相比）存在差異表達；關鍵靶基因UBE2G1在ESCC不同N分期間（N1/N2/N3與N0相比）存在差異表達（FC=0.93，P=0.03）。進一步生存分析結(jié)果表明，關鍵靶基因ATM的表達水平與ESCC患者預后相關，ATM高表達組的中位生存期為48.6個月，而ATM低表達組的中位生存期為18.6個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫ATM基因高、低表達水平的ESCC患者生存曲線

3 討論

研究表明，人類基因組中存在300多個miRNA基因簇，其中miR-17-92基因簇因參與哺乳動物多種器官發(fā)育且與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關而被廣泛關注［16］。兩個或多個miRNAs簇生排列于染色體上形成miRNA基因簇，其通過共表達影響細胞分化、增殖等生物學過程，作為一組新的癌基因或抑癌基因協(xié)同參與腫瘤相關途徑［17-18］。但到目前為止，miR-17-92基因簇在ESCC中研究較少，其在ES‐CC中的功能及作用機制尚未完全闡明。近年來，隨著高通量技術(shù)的不斷發(fā)展，大量的芯片和測序數(shù)據(jù)被收錄于各大數(shù)據(jù)庫中?；诠矓?shù)據(jù)庫挖掘及分析腫瘤相關大數(shù)據(jù)，可為腫瘤防治提供幫助。因此，本研究通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中ESCC相關miRNAs表達、基因表達及其臨床信息數(shù)據(jù)進行分析，深入挖掘miR-17-92基因簇在ESCC中的表達情況及其靶基因功能。

已有少量研究表明，miR-17-92基因簇在ESCC中存在差異表達。XU等［13］對105對ESCC組織標本分析后發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇中六個成員在ESCC中的表達水平均顯著高于正常食管組織，并提出miR-17、miR-18a和miR-19a可作為ESCC潛在預后生物標志物。許瀚等［14］在ESCC組織及細胞系中均檢測到miR-17-5p的高表達，且miR-17-5p的上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的狀態(tài)和TNM分期顯著相關。姚麗華等［15］研究表明miR-18a同樣在食管癌組織及細胞系呈現(xiàn)高表達，并提出其可作為食管癌診斷的生物標志物。本研究結(jié)果顯示，miR-17-92基因簇在ES‐CC中呈現(xiàn)表達水平上調(diào)趨勢，這與已有研究結(jié)果一致；其中miR-17-5p和miR-18a-5p表達差異最具顯著性，且這兩個miRNAs的表達水平與ESCC患者分化程度相關，表明上述兩個miRNAs可能作為關鍵miRNAs參與ESCC致病過程及癌癥進展。研究表明，miRNAs通過與靶基因3’非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達水平，進而發(fā)揮生物學功能［19-20］。因此本研究對上述關鍵miRNAs（miR-17-5p和miR-18a-5p）的靶基因進行預測及篩選，探討其發(fā)揮生物學作用的潛在機制。

本研究基于生物信息學在線網(wǎng)站預測miR-17-5p和miR-18a-5p的靶基因，并最終篩選得到14個在ESCC中呈現(xiàn)差異表達的關鍵靶基因。結(jié)果提示，這14個差異表達的關鍵靶基因可能受到miR-17-5p和miR-18a-5p的靶向調(diào)控，參與ESCC癌變進展過程。功能富集分析結(jié)果表明，上述差異表達關鍵靶基因主要參與了細胞質(zhì)、核等細胞組成；信號傳導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學過程；轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能。以上功能均是調(diào)控細胞增殖、侵襲、遷移的生物學基礎，這些生物學過程的異常可導致蛋白的異常表達和細胞的過度增殖。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)上述關鍵靶基因主要富集在癌癥通路、細胞周期、轉(zhuǎn)錄失調(diào)等腫瘤相關通路中，表明miR-17-5p和miR-18a-5p還可能通過改變相應靶基因表達水平，參與或間接調(diào)控以上腫瘤相關重要通路，在ESCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，關鍵靶基因CTDSPL、NHL‐RC3和UBE2G1的表達水平與ESCC臨床病理學特征關系密切，具有重要的臨床意義。CTDSPL屬于SCP/CTDSP亞家族，被認為是磷酸酶樣腫瘤抑制基因，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要角色。有研究表明，CTDSPL表達量與胃腸道間質(zhì)瘤的腫瘤大小和浸潤深度相關，且其表達水平受到miR-181a-5p的負向調(diào)控，進而對癌細胞的增殖活力和侵襲凋亡過程產(chǎn)生影響［20］。NHLRC3被認為通過泛素化在蛋白質(zhì)修飾過程中發(fā)揮作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，NHLRC3在胃癌及大腸癌中存在差異表達，并且視其為評估患者預后的獨立標志物。目前有關UBE2G1的研究較少，僅有一篇研究通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析后發(fā)現(xiàn)UBE2G1是與髓母細胞瘤生存性狀相關性最大的核心基因。UBE2G1在腫瘤中的作用機制目前尚不十分明確，仍需進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，關鍵靶基因ATM不僅與ESCC臨床病理學特征（T分期）相關，與患者預后間仍存在關聯(lián)，其可能成為潛在的預后分子標志物。研究表明，ATM在結(jié)直腸癌、胃癌及腎細胞癌中呈低表達水平，且與不良預后相關。ATM屬于磷酸肌醇激酶-3（PI3K）基因家族成員，編碼具有絲/蘇氨酸激酶活性的ATM蛋白，主要發(fā)揮DNA損傷的識別、修復和細胞周期調(diào)控等功能。其機制為當細胞遭受損傷因素（化學藥物、物理輻射等）刺激時，ATM可通過自身修復功能或啟動損傷細胞凋亡途徑，以保證基因組的穩(wěn)定性；但當ATM基因功能存在障礙，則會破壞其細胞自身修復能力，導致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-100通過負向靶向ATM的表達，對急性髓細胞性白血病患者的細胞活力和凋亡過程產(chǎn)生影響；在肺癌細胞中觀察到miR-18a-5p可通過下調(diào)ATM的表達水平來提高肺癌細胞和CD133+干細胞的放射敏感性。結(jié)合本研究結(jié)果，ESCC中ATM的低表達水平可能受到其上游miR-18a-5p的調(diào)控，進而導致細胞自身修復能力發(fā)生障礙，促進腫瘤的發(fā)生及進展。

綜上所述，基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中ESCC樣本數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ESCC組織中miR-17-92基因簇表達上調(diào)，并識別出兩個關鍵miRNAs（miR-17-5p、miR-18a-5p）和14個關鍵靶基因（CNOT6L、CTD‐SPL、ATM、UBE2G1等）。關鍵靶基因CTDSPL、ATM、NHLRC、UBE2G1與ESCC患者臨床病理特征有關，ATM的低表達與ESCC患者的預后差有關。本研究為ESCC的發(fā)病機制及相關生物標志物研究提供了理論依據(jù)。