劉剴剡 丁 勤 袁夢(mèng)玹 浦躍樸

(東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210009)

微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是淡水中常見(jiàn)的具有肝腎毒性的藻類(lèi)毒素[1-2],亞洲湖泊和河流中最主要的MCs變體為微囊藻毒素-RR(Microcystin-RR,MC-RR)和微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)[3].人類(lèi)活動(dòng)和全球變暖使得自然水體溫度逐年升高,水體富營(yíng)養(yǎng)化愈發(fā)普遍,MCs污染情況日趨嚴(yán)重[4-6].

微生物降解是清除水體MCs的主要途徑[7-8],鞘氨醇單胞菌(Sphingopyxissp.)是發(fā)現(xiàn)最早、研究較多的MCs降解菌[9].鞘氨醇單胞菌通過(guò)4種MCs降解基因(mlrA、mlrB、mlrC和mlrD)編碼的4種蛋白酶(MlrA、MlrB和MlrC和MlrD)發(fā)揮作用,其中MlrA作為細(xì)菌降解MCs的起始酶而受到重點(diǎn)關(guān)注[10-14].已有研究[14-16]表明,細(xì)菌降解MCs與水體溫度、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度、pH值及有機(jī)污染物種類(lèi)等因素有關(guān),但影響因素的作用途徑及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道.

本文以攜帶4種MCs降解基因的鞘氨醇單胞菌m6為研究對(duì)象,旨在通過(guò)對(duì)不同條件下MC-RR濃度、降解產(chǎn)物、基因mlrA及酶MlrA活性的檢測(cè)與分析,探究鞘氨醇單胞菌對(duì)MC-RR的降解能力、影響因素和作用機(jī)制,為生物降解MCs技術(shù)的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

本文所用主要試劑和儀器如下:MC-RR純品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于95%,中國(guó)臺(tái)灣藻研)；LB肉湯(中國(guó)青島海博)；高效液相色譜儀(HPLC,1260,美國(guó)安捷倫),超高效液相串聯(lián)多級(jí)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS,triple TOF 5600+,美國(guó)愛(ài)博才思),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500,美國(guó)賽默飛世爾)；無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(MSM培養(yǎng)基),包含1.0 g/L MgSO4·7H2O,0.5 g/L KH2PO4,4.0 g/L K2HPO4,1.0 g/L NaCl,0.02 g/L CaCl2,0.005 g/L FeSO4,0.005 g/L MnCl2·4H2O,0.005 g/L ZnCl2,0.000 5 g/L CuCl2,pH=7.0.

1.2 鞘氨醇單胞菌降解MC-RR

取m6菌株單克隆于LB肉湯中培養(yǎng)36 h,4 ℃ 5 000 r/min 離心10 min收集菌體,去離子水洗滌2次后重懸于1.0 mg/L MC-RR的MSM培養(yǎng)基中,置于30 ℃ 150 r/min搖床進(jìn)行降解反應(yīng),每組3個(gè)平行,以不含菌的反應(yīng)體系為空白對(duì)照組,定時(shí)取樣分析,并在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度(OD600).

1.3 影響因素實(shí)驗(yàn)

在不同反應(yīng)溫度(20、30和40 ℃)、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)(加磷組K2HPO4質(zhì)量濃度100 mg/L，加氮組NaNO3質(zhì)量濃度100 mg/L，加碳組葡萄糖質(zhì)量濃度100 mg/L)、MC-LR添加量(質(zhì)量濃度0、0.5和1.0 mg/L)條件下分別進(jìn)行鞘氨醇單胞菌降解MC-RR實(shí)驗(yàn),每組3個(gè)平行,以不含菌的反應(yīng)體系為空白對(duì)照組、不同營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)實(shí)驗(yàn)中以MSM培養(yǎng)基組為陰性對(duì)照組,定時(shí)取樣分析.

1.4 MC-RR降解產(chǎn)物分析

參考Ding等[14]的檢測(cè)方法測(cè)定MC-RR降解產(chǎn)物,鑒定產(chǎn)物種類(lèi).

1.5 mlrA基因表達(dá)檢測(cè)

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,委托上海捷瑞公司合成.16S rDNA作為內(nèi)參基因,引物序列參見(jiàn)表1.根據(jù)SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)并檢測(cè),結(jié)合2-ΔΔCt法分析mlrA基因相對(duì)表達(dá)量[14].

表1 相關(guān)引物序列

1.6 MlrA重組酶降解MC-RR

取重組大腸桿菌pGEx-4T-1-mlrA/BL21單克隆至LB肉湯中(含卡那霉素質(zhì)量濃度50 mg/L)培養(yǎng),經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體并于冰上破碎處理后得酶MlrA,用于MC-RR降解實(shí)驗(yàn).每組3個(gè)平行,以不加酶液的反應(yīng)體系為空白對(duì)照組，含有空載質(zhì)粒的大腸桿菌代替實(shí)驗(yàn)菌為陰性對(duì)照組,定時(shí)取樣分析.

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016、GraphPad Prism 8、SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,利用方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性差異,用Tukey法檢驗(yàn)計(jì)算P值，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著,P<0.001時(shí)認(rèn)為差異極為顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 鞘氨醇單胞菌對(duì)MC-RR的降解作用與途徑

菌株生長(zhǎng)情況及MC-RR降解曲線如圖1所示.吸光度OD600緩慢上升,說(shuō)明細(xì)菌生物量逐漸增長(zhǎng).m6菌降解MC-RR能力較強(qiáng),最高降解速率達(dá)0.29 mg/(L·h),1 h內(nèi)MC-RR降解了10.81%,6 h內(nèi)1.0 mg/L MC-RR完全降解.

圖1 鞘氨醇單胞菌降解MC-RR

對(duì)樣品做進(jìn)一步的質(zhì)譜分析,共檢測(cè)到4種降解產(chǎn)物的5個(gè)分子離子峰,并將相關(guān)信息匯總于表2,降解產(chǎn)物有:線性MC-RR C49H77N13O13,四肽化合物C32H47N4O8(3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-3甲基-10-苯基-4,6-二烯酸-異谷氨酰-脫氫丙氨酰-丙氨酸,Adda-Glu-Mdha-Ala),三肽化合物C12H19N3O6(異谷氨酰-脫氫丙氨酰-丙氨酸,Glu-Mdha-Ala)和單氨酸基團(tuán)C20H29NO3(3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-3甲基-10-苯基-4,6-二烯酸,Adda).據(jù)此推測(cè)鞘氨醇單胞菌對(duì)MC-RR的降解途徑如圖2所示:首先環(huán)狀MC-RR C49H75N13O12中Adda 基團(tuán)與精氨酸間的肽鍵斷裂,生成線性MC-RR；進(jìn)而丙氨酸與精氨酸之間的肽鍵斷裂,生成C32H47N4O8；最后降解生成C20H29NO3和C12H19N3O6.該途徑與Bourne等[11]的研究結(jié)果相似.

表2 MC-RR的降解產(chǎn)物

圖2 推測(cè)的MC-RR降解途徑

2.2 鞘氨醇單胞菌降解MC-RR的影響因素

如圖3(a)所示,在20 ～ 40 ℃范圍內(nèi)降解最適溫度為30 ℃,MC-RR降解速率最高(0.29 mg/(L·h)),40 ℃時(shí)降解速率降至0.21 mg/(L·h),20 ℃時(shí)降至0.20 mg/(L·h),說(shuō)明MC-RR的降解受到溫度的顯著影響(P<0.05).

(a) 溫度

(b) 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)

(c) MC-LR

圖3(b)顯示加磷組MC-RR最高降解速率為0.37 mg/(L·h),比陰性對(duì)照組提高了27.59%,說(shuō)明提高磷濃度可明顯促進(jìn)鞘氨醇單胞菌對(duì)MC-RR的降解(P<0.05).加入其他碳源后MC-RR降解速率銳減至0.052 mg/(L·h),下降了86.71%,說(shuō)明降解受到抑制(P<0.05).而劉凱英等[17]認(rèn)為加入其他碳源后可增強(qiáng)微生物對(duì)MC-RR的利用效率,該研究使用的DHU-38菌為熒光假單胞菌,菌株種屬與本文不同,可能是造成研究結(jié)果差異的原因之一.

圖3(c)為添加不同質(zhì)量濃度MC-LR后MC-RR的降解曲線.添加質(zhì)量濃度0.5 mg/L MC-LR使MC-RR降解速率降低了3.42%,添加質(zhì)量濃度1.0 mg/L MC-LR后則降低了4.44%.Yang等[18]也研究發(fā)現(xiàn)多種MCs共存時(shí),其中一種MC的降解速率受到抑制.根據(jù)Wan等[19]的報(bào)道,太湖梅梁灣監(jiān)測(cè)點(diǎn)MCs總質(zhì)量濃度范圍為8.60～21 237.60 ng/L,其中MC-LR的質(zhì)量濃度范圍為2～15 839.2 ng/L,MC-RR的質(zhì)量濃度范圍為2～3 013.65 ng/L,兩者檢出率均為100%.因此,研究多種MCs共同降解更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

2.3 不同影響因素下MC-RR的降解產(chǎn)物

經(jīng)質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)4種降解產(chǎn)物在各實(shí)驗(yàn)組中均有檢出(見(jiàn)表3),表明不同影響因素作用下降解產(chǎn)物種類(lèi)無(wú)差異,即MC-RR降解途徑未改變.該降解途徑中MlrA作為MC-RR降解的起始酶,對(duì)后續(xù)降解起著決定性作用[20-21],因此應(yīng)關(guān)注不同影響因素對(duì)MlrA及其編碼基因mlrA的作用及機(jī)制.

表3 不同影響因素下MC-RR的降解產(chǎn)物

2.4 不同影響因素下mlrA基因表達(dá)

如圖4(a)所示,各溫度組mlrA基因表達(dá)量均上調(diào),差異不顯著(P>0.05).這說(shuō)明在20～40 ℃范圍內(nèi),基因mlrA表達(dá)活性較高,能適應(yīng)太湖藍(lán)藻萌發(fā)期和水華暴發(fā)期的環(huán)境溫度[22-23].

圖4(b)中加磷組mlrA表達(dá)量最高,較陰性對(duì)照組提高了49.74%;加碳組mlrA表達(dá)量最低,為陰性對(duì)照組的13.29%.不同營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中的mlrA表達(dá)量存在極顯著差異(P<0.001),說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)影響mlrA表達(dá)量,進(jìn)而造成MC-RR降解速率變化.也有研究[24]認(rèn)為,提高磷濃度會(huì)增強(qiáng)對(duì)磷需求量大的降解菌的微生物活性,促進(jìn)MCs降解速率.

由圖4(c)可知,mlrA表達(dá)量隨MCs總濃度變大而上升.添加質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的 MC-LR使mlrA表達(dá)量提高23.00%,說(shuō)明mlrA的表達(dá)量依賴(lài)于底物濃度.當(dāng)前研究普遍認(rèn)為MCs作為胞外信號(hào)分子可誘導(dǎo)mlrA表達(dá)[25-26],且MCs濃度越高則mlrA的轉(zhuǎn)錄越快速,表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)越高[27].

(a) 溫度

(b) 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)

(c) MC-LR

2.5 MlrA降解MC-RR

MlrA催化降解MC-RR的結(jié)果如圖5(a)所示.MlrA能在20 ～ 40 ℃溫度下催化MC-RR降解,此范圍內(nèi)最適溫度為30 ℃.各組間速率差異顯著(P<0.05),說(shuō)明反應(yīng)溫度通過(guò)改變MlrA的催化活性對(duì)MC-RR降解產(chǎn)生影響.

如圖5(b)所示,添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的MC-LR后,MC-RR最高降解速率下降至0.41 mg/(L·h),降低了24.52%；添加質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的MC-LR則使MC-RR最高降解速率降低了61.11%,表明MC-LR和MC-RR同時(shí)被MlrA催化時(shí)出現(xiàn)了速率抑制.有研究[1,28]認(rèn)為MCs降解菌(B-9)可識(shí)別肽序MeAsp-Arg-Adda并選擇性水解肽鍵Arg-Adda,從而降解含有肽鍵Arg-Adda的MCs類(lèi)似物.MC-LR和MC-RR均具有肽序MeAsp-Arg-Adda及肽鍵Arg-Adda,二者降解途徑類(lèi)似[29],MlrA同時(shí)催化時(shí)形成了酶競(jìng)爭(zhēng)從而導(dǎo)致降解速率降低.

(a) 溫度

(b) MC-LR

MCs的分子特性賦予其結(jié)構(gòu)多變性,但目前研究主要集中在MC-LR、MC-RR及微囊藻毒素-YR(Microcystin-YR,MC-YR)三種毒素上.對(duì)不同底物催化作用認(rèn)識(shí)的局限性導(dǎo)致MlrA的底物選擇機(jī)制及其與各種MCs之間的結(jié)合機(jī)制尚不明確,因此后續(xù)研究將進(jìn)一步闡明降解酶與MCs之間的構(gòu)效關(guān)系.

3 結(jié)論

1) 鞘氨醇單胞菌具有高效的MC-RR降解作用,最高降解速率為0.29 mg/(L·h), 同時(shí)受到反應(yīng)溫度、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和同類(lèi)毒素濃度的影響.

2) 鞘氨醇單胞菌對(duì)MC-RR和 MC-LR的降解途徑相似:首先環(huán)狀MC-RR中Adda 基團(tuán)與精氨酸間的肽鍵斷裂,生成線性MC-RR；進(jìn)而丙氨酸與精氨酸之間的肽鍵斷裂,生成C32H47N4O8；最后降解生成C20H29NO3和C12H19N3O6.降解途徑不受反應(yīng)溫度、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和同類(lèi)毒素濃度的影響.

3) 營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)可調(diào)控mlrA基因表達(dá)量進(jìn)而影響MC-RR降解速率:提高反應(yīng)體系磷濃度對(duì)mlrA表現(xiàn)為促進(jìn)作用,降解速率提高27.59%;提高碳濃度對(duì)mlrA表現(xiàn)為抑制作用,降解速率下降86.71%.反應(yīng)溫度可改變MlrA活性,同類(lèi)毒素之間對(duì)MlrA存在競(jìng)爭(zhēng),影響MC-RR降解速率.