楊芳潔，吳大偉，何 堅*

（1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州350122；2.江蘇省鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城224000）

頸椎病是一種與年齡有關(guān)的常見頸椎退行性疾?。?］，我國頸椎病的患病率為17.3%，其中神經(jīng)根型頸椎?。╟ervical spondylotic radiculopathy，CSR）占60%～70%［2］。該病的主要臨床表現(xiàn)為神經(jīng)根性痛，炎癥介質(zhì)是誘發(fā)CSR疼痛的關(guān)鍵因素［3］。最新研究報道，NLRP3炎性小體的合成與釋放在神經(jīng)根性疼痛中具有重要作用［4］。芍藥甘草湯可柔肝益脾、通順血脈、緩急止痛，是治療痙攣疼痛的良方。本團隊前期研究證明芍藥甘草湯對于治療頸椎病有效［5-6］，但芍藥甘草湯治療急性期CSR的作用機制尚未明確。本研究采用“椎管插線法”建立急性期CSR大鼠模型［7］，探討芍藥甘草湯對CSR模型大鼠的可能作用機制，為芍藥甘草湯臨床療效的科學內(nèi)涵以及進一步推廣提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60只健康成年的SPF級SD大鼠，鼠齡6～8周，體質(zhì)量200～250g，于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（閩）2012-001。

1.2 實驗藥物 芍藥甘草湯藥物組成：白芍12g，甘草12g，購自福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院中藥房的顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限公司）。

1.3 實驗試劑 蘇木素伊紅染液（北京索萊寶公司）；rat IL-18 Elisa Kit（上海西唐生物公司）；Anti-NLRP3 antibody（英國艾博抗公司）。

1.4 實驗儀器 YB-6LF生物組織石蠟包埋機（湖北陽光科技有限公司）；RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；BH-2德國光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Tecan M200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；Leica DM4000B熒光顯微鏡（德國Leica公司）；ChemiDocXRS+System超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；BioSpec 70／20USR小動物核磁成像系統(tǒng)（美國BRUKER公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組 將大鼠分為假手術(shù)組（n＝12）和造模組（n＝48），適應性喂養(yǎng)1周后參照文獻［7］對造模組大鼠進行造模，術(shù)后予注射慶大霉素防止局部感染。造模第2天采用影像學測評結(jié)合BBB評分［8］驗證造模是否成功之后進行藥物干預。

2.2 干預方法 將造模組隨機分為模型組、芍藥甘草湯低劑量組（低劑量組）、芍藥甘草湯中劑量組（中劑量組）和芍藥甘草湯高劑量組（高劑量組）各12只。低、中、高劑量組大鼠分別按1.08、2.16、4.23 g／（kg·d）予芍藥甘草湯藥液進行灌胃，假手術(shù)組及模型組以同等劑量予生理鹽水灌胃，早、晚各灌1次，連續(xù)干預1周。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 機械痛閾測定 分別于藥物干預后的第1天、第3天及第7天，采用up-and-down法通過Von Frey纖維絲測定各組大鼠后腳趾對機械刺激50%縮爪閾值的變化。

2.3.2 IL-18檢測 于末次閾值測定后，在深度麻醉下經(jīng)腹主動脈采全血，采用酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清IL-18含量，用酶標儀在450 nm波長下測量光密度（OD值）。

2.3.3 脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù) 每組隨機選取6只大鼠，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉并取血后取出脊髓組織。采用蘇木素染色以及伊紅染色法將大鼠頸脊髓組織染色后，使用光學顯微鏡高倍光鏡下觀察各組大鼠頸部脊髓組織中脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量的變化情況。

2.3.4 檢測脊髓組織中NLRP3蛋白表達水平 采用蛋白印跡法檢測頸部脊髓組織中NLRP3蛋白的表達水平，用超高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影與分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 5組大鼠機械痛閾值比較 見表1。

表1 5組大鼠機械痛閾值比較（±s）s

表1 5組大鼠機械痛閾值比較（±s）s

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組相比，2）P＜0.01；與低劑量組相比，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 1212121212術(shù)后1 d 13.41±1.3111.16±1.021）11.33±1.541）11.25±0.971）11.08±1.241）術(shù)后3 d 13.25±1.849.91±0.991）10.41±0.901）10.00±1.201）10.08±0.791）術(shù)后7 d 12.91±1.316.91±1.311）6.83±1.191）10.33±1.151）2）3）10.08±0.991）2）3）

3.2 5組大鼠頸部脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù) 見圖1、表2。

圖1 5組大鼠頸部脊髓前角HE染色圖（×400）

表2 5組大鼠頸部脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù)（±s） 個／高倍視野

表2 5組大鼠頸部脊髓前角運動神經(jīng)元計數(shù)（±s） 個／高倍視野

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 66666數(shù)目62.2±6.735.9±4.21）47.9±4.22）54.9±4.42）3）58.2±5.72）3）

3.3 5組大鼠頸部脊髓NLRP3蛋白表達比較 見圖2、表3。

圖2 5組大鼠脊髓NLRP3蛋白電泳圖

表3 5組大鼠頸部脊髓NLRP3蛋白表達比較（±s）

表3 5組大鼠頸部脊髓NLRP3蛋白表達比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與低劑量組比較，4）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n66666 NLRP351.57±3.3791.71±5.261）83.42±4.922）59.34±7.363）4）51.64±5.153）4）

3.4 5組大鼠IL-18表達水平比較 見表4。

表4 5組大鼠IL-18表達水平比較（±s）pg／mL

表4 5組大鼠IL-18表達水平比較（±s）pg／mL

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 1212121212 IL-1840.11±3.9480.79±2.231）75.37±2.0053.93±5.622）3）50.54±4.082）3）

4 討論

大量證據(jù)表明，在急性CSR的脊髓損傷中，炎癥反應起關(guān)鍵作用［3，9］。NLRP3作為炎癥反應的核心，是最典型的炎性小體，其在介導CSR的炎癥中至關(guān)重要。感覺神經(jīng)損傷后，位于脊髓背角的NLRP3炎性小體被激活，誘導半胱氨酸蛋白酶-1，進而促進IL-18的合成，并通過多個下游信號通路促使神經(jīng)炎癥反應，引起神經(jīng)元損傷［10］。而神經(jīng)元存活是脊髓損傷后功能恢復的基礎(chǔ)［11］。本研究結(jié)果顯示，模型組NLRP3炎性小體信號通路蛋白及IL-18表達升高，各劑量組NLRP3蛋白及IL-18表達均降低；模型組大鼠脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，各劑量組運動神經(jīng)元數(shù)量增加明顯。由此可見，抑制小膠質(zhì)細胞活化，阻斷持續(xù)性炎癥，促使神經(jīng)元存活是治療急性CSR的關(guān)鍵。

不僅如此，NLRP3炎性小體活化增強，釋放炎癥因子IL-18時，還會加速痛覺傳導，導致自發(fā)性疼痛、痛覺過敏（對傷害性刺激的痛覺增加）和機械性超敏（對正常無害刺激的痛覺過敏）［12］。本實驗機械痛閾結(jié)果表明，模型組大鼠的3次痛閾值持續(xù)降低，中、高劑量組的痛閾值顯著增高。由此可見，在神經(jīng)性疼痛中，當神經(jīng)系統(tǒng)受到損害時，其敏感性的變化會持續(xù)存在，產(chǎn)生疼痛，痛閾值會急劇下降，導致無害的刺激也會產(chǎn)生疼痛，并且對有害刺激的反應持續(xù)時間和強度也會增加［13］。因此，芍藥甘草湯可通過抑制NLRP3炎性小體，進而抑制機體炎癥反應，保護神經(jīng)根型頸椎病大鼠神經(jīng)根組織，產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛的功效。

綜上所述，芍藥甘草湯對CSR大鼠模型有明顯鎮(zhèn)痛作用，能夠緩解局部的炎癥損傷，抑制脊髓局部NLRP3炎性小體活化，進而抑制促炎性細胞因子IL-18的表達，這可能是芍藥甘草湯治療大鼠急性期CSR的作用機制之一。本實驗僅對頸部脊髓前角相關(guān)神經(jīng)組織進行研究，而在背根神經(jīng)結(jié)等處是否具有相同的作用機制目前尚不清楚，還有待進一步深入研究。