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        當(dāng)歸芍藥散加味方對(duì)乳腺增生大鼠sFas及Fas/FasL表達(dá)的影響

        2021-06-10 10:53:22張婷婷張建偉
        福建中醫(yī)藥 2021年5期
        關(guān)鍵詞:方組芍藥造模

        張婷婷,王 蘋,張建偉

        (福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,福建 福州350122)

        當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略方論》,由當(dāng)歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)、澤瀉組成,全方從肝脾入手,意在使肝氣條達(dá),脾氣健運(yùn),肝脾同調(diào),氣血兩和,虛實(shí)兼顧,為調(diào)和肝脾類方之祖,又有氣血濕(痰)同治之妙。通過(guò)前期的研究基礎(chǔ)表明,乳腺增生病各證型間凋亡指數(shù)和相關(guān)凋亡基因的表達(dá)有一定的差異性;從肝脾著眼活血散結(jié)治療乳腺增生病在改善臨床癥狀、縮小腫塊方面確實(shí)有效,并可通過(guò)影響乳腺組織上皮細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程達(dá)到一定的干預(yù)治療目的。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上,緊扣乳腺增生病的病機(jī),以乳腺增生模型動(dòng)物為觀察對(duì)象,觀察當(dāng)歸芍藥散加味方對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清sFas、Bcl-2和乳腺組織Fas、FasL表達(dá)的影響,目的在于闡明該方是否通過(guò)干預(yù)乳腺增生組織Fas/FasL系統(tǒng)來(lái)抑制乳腺組織細(xì)胞增生,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而抑制/逆轉(zhuǎn)乳腺增生,降低增生程度,為拓展經(jīng)方應(yīng)用范圍和經(jīng)方開(kāi)發(fā)、研制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD雌性健康未孕大鼠,10周齡,體質(zhì)量(193.78±5.78)g,購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 當(dāng)歸芍藥散加味方組成:當(dāng)歸15g,芍藥15g,川芎8g,茯苓10g,白術(shù)15g,澤瀉10g,浙貝母12g,柴胡8g,香附12g,丹參15g,由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院藥房提供。將生藥經(jīng)蒸餾水浸泡1h,文火煎煮2次,每次60 min,取汁合并,4層紗布過(guò)濾2次,70~80℃水浴濃縮為240%濃度的藥液(含生藥1 g/mL),冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。乳消Ⅲ膠囊溶于生理鹽水,由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑科提供(院內(nèi)制劑)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司);黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份公司);10%水合氯醛溶液、中性樹(shù)膠、多聚賴氨酸、sFas和Bcl-2 ELISA試劑盒、Fas和FasL SABC試劑盒、PBS緩沖液、蘇木素染色液(北京索萊寶科技有限公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常對(duì)照組12只、實(shí)驗(yàn)組48只。實(shí)驗(yàn)組采用雌、孕激素序貫法造模,按體質(zhì)量0.5mg/(kg·d)于大鼠后肢后外側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇,每日1次,左右交替,連續(xù)25 d;繼而用黃體酮5mg/(kg·d)注射,每日1次,連續(xù)5 d。正常對(duì)照組肌肉注射生理鹽水0.1mL/只,每日1次,連續(xù)30 d。

        2.2 分組與干預(yù)雌、孕激素聯(lián)合給藥造模完成后,實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為模型1組、模型2組、當(dāng)歸芍藥散加味方組、乳消Ⅲ膠囊組,每組12只。模型1組,斷頭處死,取下第二、三對(duì)乳房組織,經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋制片后,觀察造模是否成功,另外也與實(shí)驗(yàn)結(jié)束后模型2組進(jìn)行比較,觀察增生的乳腺組織是否存在自我復(fù)舊;模型2組與正常對(duì)照組大鼠均按1mL/(kg·d)予生理鹽水灌胃;當(dāng)歸芍藥散加味方組按1 g/(kg·d)予當(dāng)歸芍藥散加味方藥液灌胃;SD大鼠中劑量是成人劑量的6.25倍,按15粒/(成人·d)計(jì),乳消Ⅲ膠囊組按1.5625粒/(kg·d)予乳消Ⅲ膠囊藥液灌胃,每組均連續(xù)灌胃30 d。

        2.3 標(biāo)本采集 大鼠灌胃30 d后,禁食24h,通過(guò)隨機(jī)抽取方式,每組隨機(jī)取8只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)。運(yùn)用腹腔注射麻醉藥的方法,予10%水合氯醛(1mL/kg)麻醉后,腹主動(dòng)脈取血4mL,加入肝素抗凝,待做血清檢測(cè)。取血后處死大鼠,經(jīng)乳頭向基底部最大面積取下第二對(duì)完整乳房組織,10%福爾馬林溶液固定,等待做組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)。

        2.4 觀察指標(biāo)及方法

        2.4.1 病理學(xué)觀察 常規(guī)取材后,通過(guò)固定、脫水、石蠟包埋切片、HE染色,在光學(xué)顯微鏡下對(duì)乳腺組織切片進(jìn)行觀察。

        2.4.2 ELISA法檢測(cè)血清sFas、Bcl-2表達(dá) 腹主動(dòng)脈取血4mL加入肝素鈉抗凝,混合均勻,1000 r/min后收集血清,置-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫占旱脑嚬芗捌髅缶嵩春蛢?nèi)毒素,標(biāo)本無(wú)溶血及絮狀沉淀,采用ELISA法檢測(cè)sFas、Bcl-2,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

        2.4.3 免疫組化SABC法檢測(cè)乳腺上皮組織Fas、FasL表達(dá) 取大鼠第二對(duì)乳房,用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋切片,HE染色后,應(yīng)用免疫組化SABC法檢測(cè)大鼠乳腺組織Fas、FasL陽(yáng)性表達(dá)情況,采用Olympus(BH-2)照相顯微鏡觀察并攝片。

        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。

        3 結(jié)果

        3.1 大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)變化 在鏡下可見(jiàn),正常對(duì)照組保持靜息期狀態(tài),主要呈現(xiàn)脂肪族和結(jié)締組織,腺管、腺泡數(shù)量、大小均正常;模型1組和模型2組大鼠的乳腺組織與正常對(duì)照組比較,乳腺導(dǎo)管上皮出現(xiàn)了明顯的增生,乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張,乳腺腺泡及小葉數(shù)量增多,部分大的乳腺導(dǎo)管腔內(nèi)還可以見(jiàn)到部分脫落的上皮細(xì)胞或者嗜酸性分泌物,2組乳腺組織無(wú)明顯差異,說(shuō)明模型2組在停止造模后沒(méi)有自愈傾向;當(dāng)歸芍藥散加味方組和乳消Ⅲ膠囊組與模型組比較,增生程度均有明顯改善,乳腺腺泡和導(dǎo)管上皮增生程度有明顯改善,但從顯微鏡下觀察來(lái)看2組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

        圖1 5組大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)HE染色(×100)

        3.2 5組大鼠血清sFas和Bcl-2濃度比較 見(jiàn)表1。

        表1 5組大鼠血清sFas和Bcl-2濃度比較(±s) μg/L

        表1 5組大鼠血清sFas和Bcl-2濃度比較(±s) μg/L

        注:與正常對(duì)照組比較,1)P<0.01;與模型2組比較,2)P<0.01;與乳消Ⅲ膠囊組比較,3)P<0.01。

        組別正常對(duì)照組模型1組模型2組乳消Ⅲ膠囊組當(dāng)歸芍藥散加味方組n 88888 sFas 1.06±0.5312.42±3.681)12.63±3.321)6.92±1.421)2)6.07±2.061)2)Bcl-21.01±0.022.09±0.061)2.07±0.061)1.70±0.021)2)1.52±0.021)2)3)

        3.3 5組大鼠乳腺組織Fas和FasL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 見(jiàn)圖2、圖3、表2。

        4 討論

        乳腺增生病在臨床多見(jiàn)女性發(fā)病,病程長(zhǎng),反復(fù)發(fā)作,有一定惡變傾向。臨床上本病常見(jiàn)病機(jī)有:肝氣郁滯、肝郁脾虛、肝腎虧虛、沖任失調(diào),同時(shí)也有氣滯、痰阻、血瘀等病理變化。中醫(yī)治療本病的方式多樣,在緩解患者臨床癥狀及降低惡變率方向有良好的作用[1-2]。目前臨床治療有內(nèi)治法和外治法,內(nèi)治法緊扣乳腺增生病的發(fā)病病機(jī),通過(guò)疏肝、健脾、補(bǔ)腎、調(diào)補(bǔ)沖任及活血、化痰、散結(jié)為大法;外治法包括了針灸、局部乳房按摩、外用膏藥敷貼等,均有確切的療效。

        目前中藥治療乳腺增生病多從肝、腎角度入手,以行氣、活血、散結(jié)為主。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn),本病可從肝脾入手,痰瘀同治,擬定《金匱要略》當(dāng)歸芍藥散為主方,加味運(yùn)用于臨床療效顯著,同時(shí)還用此方開(kāi)展了多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,探討本方治療乳腺增生病的作用機(jī)理。當(dāng)歸芍藥散加味方是在原方的基礎(chǔ)上加入了柴胡、香附、丹參、浙貝母,既可增強(qiáng)疏肝解郁、理氣活血的力度,又能加強(qiáng)化痰散結(jié)之功,使得全方更符合乳腺增生病之肝脾失調(diào)、痰瘀互結(jié)乳絡(luò)的病機(jī)特點(diǎn)。

        近幾年來(lái),關(guān)于本病在動(dòng)物模型研究方面,①模型動(dòng)物的選擇方面[3]:篩選復(fù)制率高、周期短、生存周期長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)成本合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,比如目前常用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物有SD大鼠、Wistar大鼠、豚鼠、昆明小鼠、新西蘭兔等;②中醫(yī)證型的動(dòng)物模型復(fù)制:如賈敏等[4]運(yùn)用了復(fù)合造模的方法建立了肝郁氣滯證的乳腺增生模型大鼠,這種模型塑造更為符合中醫(yī)的研究特點(diǎn)。

        圖2 大鼠乳腺組織Fas免疫組化圖(×400)

        圖3 大鼠乳腺組織FasL免疫組化圖(×400)

        表2 大鼠乳腺組織Fas和FasL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較(±s)%

        表2 大鼠乳腺組織Fas和FasL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較(±s)%

        注:與對(duì)照組比較,1)P<0.01;與模型2組比較,2)P<0.05;與乳消Ⅲ膠囊組比較,3)P<0.05。

        組別正常對(duì)照組模型1組模型2組乳消Ⅲ膠囊組當(dāng)歸芍藥散加味方組n 88888 Fas 71.56±14.1133.50±12.681)36.71±11.951)51.71±14.081)2)55.75±16.611)2)3)FasL 46.39±8.1866.96±10.741)67.75±9.351)58.04±6.231)2)56.20±7.161)2)3)

        Fas/FasL系統(tǒng)包括了Fas、FasL和sFas三種形式,在人體內(nèi)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)對(duì)機(jī)體的平衡穩(wěn)定發(fā)揮重要作用,但若該系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常,則會(huì)引發(fā)組織增生惡變或者是組織間相互致死。Fas/FasL系統(tǒng)調(diào)控主要集中于免疫和腫瘤凋亡相關(guān)方面,其調(diào)控異常導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡受抑制,機(jī)體的免疫監(jiān)控機(jī)制出現(xiàn)監(jiān)控失常,腫瘤細(xì)胞就出現(xiàn)了逃逸現(xiàn)象,逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控[5-6]。我們從近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道上看,該系統(tǒng)的研究運(yùn)用于乳腺疾病方面涉及的多是乳腺癌的相關(guān)研究,有乳腺癌的發(fā)病機(jī)制探討、預(yù)后轉(zhuǎn)歸的判斷及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,部分學(xué)者將此通路系統(tǒng)運(yùn)用于乳腺增生疾病中,但報(bào)道相對(duì)較少。

        我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中就猜想,當(dāng)歸芍藥散加味方在治療乳腺增生病的作用機(jī)制是否通過(guò)調(diào)控機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到治療本病的作用,所以本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fas/FasL系統(tǒng)中Fas、FasL、sFas的表達(dá)和Bcl-2基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)在正常的大鼠乳腺組織中有表達(dá),其特點(diǎn)是Fas高表達(dá),F(xiàn)asL、sFas表達(dá)較低;而復(fù)制乳腺增生病模型大鼠體內(nèi)則是Fas表達(dá)降低,F(xiàn)asL、sFas表達(dá)增高;經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后,當(dāng)歸芍藥散加味方組在增加Fas在乳腺組織中的表達(dá)、降低FasL和sFas的表達(dá)優(yōu)于乳消Ⅲ膠囊組。另外,從Bcl-2表達(dá)情況看,在模型組中高表達(dá),通過(guò)藥物治療后表達(dá)下降。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè),當(dāng)歸芍藥散加味方對(duì)乳腺增生組織Fas/FasL系統(tǒng)有一定干預(yù)作用,通過(guò)提高Fas和降低FasL的表達(dá),抑制乳腺組織上皮細(xì)胞的增生,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制/逆轉(zhuǎn)乳腺增生的作用。然而本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究周期相對(duì)較短,對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表現(xiàn)是否是素體本身內(nèi)在一系列基因的激化、表達(dá)及自我調(diào)控的結(jié)果,或者在時(shí)間上有滯后性,這也有待于進(jìn)一步的研究。

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