劉永青 趙鈺瑋 張 健 劉光輝

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省兒童醫(yī)院新生兒科，合肥市 230051，電子郵箱：2967520671@qq.com)

隨著新生兒急救技術(shù)和重癥監(jiān)護(hù)水平的不斷提高，新生兒的死亡率明顯下降[1]，但新生兒腦損傷的發(fā)生率并沒有隨之下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病占新生兒常見病的33.7%，早產(chǎn)兒存活者中約10%發(fā)生腦癱，25%～50%的極低出生體重兒會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知、行為或社交障礙[2]，這使得家庭和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的負(fù)擔(dān)日益沉重。氧療是危重新生兒常用的重要治療方法之一，但高濃度氧氣對(duì)于新生兒尤其早產(chǎn)兒存在一定副作用。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)證實(shí)吸入高濃度氧能引起早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良和視網(wǎng)膜病變[3-4]，越來(lái)越多的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)高濃度氧是引起早產(chǎn)兒嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的高危因素之一[5]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明硫酸鎂具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[6-8]，但其對(duì)高氧性腦損傷是否具有治療作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立高氧性腦損傷的動(dòng)物模型，探究硫酸鎂對(duì)未成熟腦神經(jīng)發(fā)育的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD新生大鼠30只，雌雄不限，體重20～25 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):scxk(皖)2017-00。新生小鼠同母鼠同籠飼養(yǎng)于室溫(20℃～24℃)、相對(duì)濕度45%～55%的環(huán)境，12 h/12 h明暗交替，給予充足滅菌飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 硫酸鎂注射液(上海錦帝九州藥業(yè)，產(chǎn)品批號(hào)：19024110020)；谷氨酸、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)檢測(cè)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：JYM0952Ra、JYM0325Ra)；過氧化脂質(zhì)(lipid peroxide,LOP)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：MM-0890R1)；TRIzol試劑(Invitrogen公司，Lot：79406)；SYBR Green實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa公司，產(chǎn)品批號(hào)：RR820A)；PCR試劑(TakaRa公司，產(chǎn)品批號(hào)：RR820A)。PCR引物由美國(guó)Invitrogen公司提供，白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1上游引物序列為5′-ATCAGCACCTCACAGCTTCC-3′，下游引物序列為5′-CTCTCCTCCCGATGAGTAGGC-3′；內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物序列為5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′，下游引物序列為5′-GTCATCCATGGCGAACTGGTG-3′。

1.3 儀器與設(shè)備 數(shù)字測(cè)氧儀(ProOx Model 110,BioSpherix公司)；紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào)：TU-1810)；實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：7500)。

1.4 模型的制備及分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將30只新生大鼠分為對(duì)照組、高氧組、硫酸鎂組各10只。高氧組及硫酸鎂組新生大鼠同哺乳母鼠共置于高氧箱中24 h，持續(xù)通入醫(yī)用氧氣，并用數(shù)字測(cè)氧儀持續(xù)監(jiān)測(cè)箱內(nèi)氧氣濃度，維持箱內(nèi)氧氣濃度為80%左右；而對(duì)照組新生大鼠與哺乳母鼠置于同室空氣中飼養(yǎng)。新生大鼠出現(xiàn)活動(dòng)少，反應(yīng)差，精神萎靡，呼吸促，四肢末端和口鼻處不同程度發(fā)紺，則提示成功建立高氧性腦損傷模型。硫酸鎂組大鼠建模成功后，分別于生后第7天、第8天、第9天腹腔注射50 mg/kg硫酸鎂。對(duì)照組和高氧組不做處理。

1.5 標(biāo)本的采集和處理 將各組新生大鼠隨機(jī)等分為兩個(gè)亞組，分別于日齡10 d、14 d斷頭取腦。用10%水合氯醛2.0 mL腹腔注射麻醉后，將新生大鼠固定于自制手術(shù)板上，開胸暴露心臟，在左心室插入灌流針并固定，同時(shí)剪開大鼠右心耳，通過灌流針緩慢灌注4℃的磷酸鹽緩沖溶液，直至肝臟顏色轉(zhuǎn)白并且右心耳流出液體為澄清，斷頭取腦，將標(biāo)本轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱中保存。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定谷氨酸、GABA、LOP濃度 冰上進(jìn)行組織勻漿操作，4℃下10 000 r/min離心5 min，吸取上清800 μL，另補(bǔ)充200 μL磷酸鹽緩沖液制備成1 000 μL液體，再次以10 000 r/min離心5 min，吸取上清900 μL作為待測(cè)樣品。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL，進(jìn)行溫育(37℃、30 min)、洗滌，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL后再次進(jìn)行溫育(37℃、30 min)、洗滌，在加入顯色劑后10 min加入終止劑，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔的吸光度。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定IL-1 mRNA表達(dá)水平 冰上進(jìn)行組織勻漿操作，4℃下10 000 r/min離心5 min后加入200 μL氯仿，待其自然分層后4℃下10 000 r/min繼續(xù)離心10 min后吸取上清，加入等體積的異丙醇沉淀RNA，棄去上清，75%乙醇清洗RNA后干燥RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程：在0.2 mL微量離心管(EP管)中加入總RNA 5 μL、Oligo(dT)1 μL、無(wú)RNA酶水6 μL，置于65℃下孵育5 min，立即冰浴3 min；在上述管中加入5×反應(yīng)緩釋液4.0 μL、10 mmol/L dNTP 2.0 μL、RNasin 1.0 μL、M-MuLV 1 μL；混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：42℃ 60 min，70℃ 5 min，獲得cDNA。配置反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 2.0 μL，2×SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液10 μL，PCR上游引物0.4 μL，PCR下游引物0.4 μL，50×ROX 0.4 μL，超純水6.8 μL。PCR反應(yīng)溶液在95℃下預(yù)變性30 s，在95℃下變性5 s，60℃下退火和延伸34 s，循環(huán)數(shù)設(shè)定相對(duì)表達(dá)水平為40。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組不同日齡新生大鼠腦組織LOP、谷氨酸濃度、谷氨酸/GABA比值的比較 無(wú)論是日齡10 d的大鼠還是日齡14 d的大鼠，高氧組谷氨酸濃度、谷氨酸/GABA比值、LPO濃度均較對(duì)照組和硫酸鎂組升高(均P<0.05)。見表1。

表1 3組不同日齡大鼠腦組織的LOP、谷氨酸濃度、谷氨酸/GABA比值的比較(x±s)

2.2 3組不同日齡新生大鼠腦組織IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 無(wú)論是日齡10 d還是日齡14 d的大鼠，高氧組的IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于硫酸鎂組和對(duì)照組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組不同日齡新生大鼠腦組織IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

鎂離子作為人體必需元素之一，是細(xì)胞新陳代謝所需的多種金屬活化酶的重要成分，涉及細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)與核酸代謝、糖異生、氧化磷酸化等重要生物學(xué)過程，并參與維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[9]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明硫酸鎂具有減輕興奮性中毒、抗炎、抗氧化等作用[10-12]，但大部分研究主要針對(duì)產(chǎn)前的預(yù)防和產(chǎn)后缺氧缺血性損傷的治療。新生兒尤其是早產(chǎn)兒暴露于高氧環(huán)境中，神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)生率顯著增加[13]。在生理狀態(tài)下，機(jī)體的活性氧維持在正常水平，當(dāng)機(jī)體清除機(jī)制失敗或者抗氧化劑不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致氧化產(chǎn)物累積，過度的氧化應(yīng)激將破壞核苷酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，使細(xì)胞功能受損[14]。由于日齡6 d新生鼠大腦發(fā)育情況與28～32周早產(chǎn)兒大腦相似[15]，為明確早產(chǎn)兒高氧性腦損傷后硫酸鎂是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)通過建立日齡6 d新生大鼠高氧性腦損傷模型，探討硫酸鎂對(duì)高氧性腦損傷大鼠是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性氨基酸遞質(zhì)，腦內(nèi)95%以上的突觸是以谷氨酸為遞質(zhì)的興奮性突觸。谷氨酸通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，從而保護(hù)神經(jīng)元，避免興奮性毒性損傷神經(jīng)元[16]。而GABA是神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性氨基酸，在生理狀態(tài)下，兩者保持動(dòng)態(tài)平衡[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠比較，高氧組新生大鼠腦組織損傷后產(chǎn)生大量谷氨酸，且谷氨酸/GABA比值明顯升高，即兩者之間平衡被打破；而硫酸鎂組大鼠腦組織谷氨酸含量、谷氨酸/GABA比值均較高氧組大鼠降低，說明硫酸鎂對(duì)高氧性腦損傷大鼠具有抑制興奮性氨基酸的作用。Huang等[18]通過微透析評(píng)估脊髓損傷大鼠細(xì)胞外谷氨酸水平，發(fā)現(xiàn)注射AC105(聚乙二醇+鎂離子溶液)可顯著降低細(xì)胞外谷氨酸水平，同樣提示鎂離子可減輕興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性?？紤]可能是因?yàn)榱蛩徭V能夠阻斷谷氨酸受體的N-甲基-天冬氨酸-亞型，并拮抗N型、P型和L型鈣通道，防止鈣流入的同時(shí)限制乙酰膽堿釋放和神經(jīng)肌肉接頭處的刺激，從而可預(yù)防細(xì)胞內(nèi)鈣離子過量引起的興奮性損傷[10]。

LPO是不飽和脂肪酸經(jīng)自由基作用所形成的過氧化物。正常狀態(tài)下其濃度較低，機(jī)體出現(xiàn)病理改變時(shí)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可增強(qiáng)，從而導(dǎo)致LPO濃度增加，引起細(xì)胞及細(xì)胞膜功能及結(jié)構(gòu)受損[19]。Peker等[20]在大鼠脊髓輻射損傷后24 h測(cè)定丙二醛水平以評(píng)估脂質(zhì)過氧化水平，發(fā)現(xiàn)硫酸鎂組丙二醛水平顯著低于對(duì)照組(腹腔注射生理鹽水)，認(rèn)為硫酸鎂對(duì)輻射誘導(dǎo)的大鼠脊髓氧化應(yīng)激有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高氧損傷后新生大鼠腦組織LPO濃度增高，而硫酸鎂組大鼠經(jīng)硫酸鎂干預(yù)后腦組織LPO濃度低于高氧組，提示硫酸鎂有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。這可能與鎂離子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合磷脂離子連接點(diǎn)，抑制活性氧簇和一氧化氮的生成及脂質(zhì)過氧化、黃嘌呤氧化酶生成，減少超氧化物歧化酶增多有關(guān)[21]。

高氧暴露會(huì)極大增加細(xì)胞間隙的氧自由基釋放，從而激活核因子κB信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥因子釋放，引起下游 IL-1β、腫瘤壞死因子α 等炎癥因子的增多，破壞了血腦屏障，導(dǎo)致炎癥因子及有害物質(zhì)迅速透過血腦屏障[22]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)硫酸鎂可降低胎盤缺氧孕鼠腦脊液中的細(xì)胞因子水平；Burd等[24]通過給孕鼠模型宮內(nèi)注射脂多糖，發(fā)現(xiàn)硫酸鎂組宮內(nèi)胎鼠的腦組織中細(xì)胞因子表達(dá)量明顯下降。上述兩個(gè)研究結(jié)果均提示，鎂離子可以抑制損傷腦組織的炎性因子生成和活化，以及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高氧損傷后新生大鼠腦組織IL-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高，而硫酸鎂組mRNA表達(dá)水平較高氧組明顯下降，提示硫酸鎂可顯著降低腦組織中高氧所致的炎癥因子水平，從而起到保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用。

綜上所述，硫酸鎂可抑制腦組織興奮性氨基酸的產(chǎn)生、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng),對(duì)高氧性腦損傷新生大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。