秦 龍 羅彬予 李 婷 呂真冰

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院/南充市中心醫(yī)院胃腸疝外科，四川省南充市 637000，電子郵箱：long821127@126.com)

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，主要與原癌基因c-kit或血小板源性生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRA)基因突變有關(guān)[1]。選擇性c-kit/PDGFRA受體酪氨酸激酶抑制劑—甲磺酸伊馬替尼的問世，破解了GIST的治療難題[2]。但隨著治療的深入，甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)性耐藥已成為GIST臨床治療的主要問題。目前，有關(guān)甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)性耐藥發(fā)生機(jī)制的研究主要集中于c-kit/PDGFRA基因二次突變誘導(dǎo)的受體再激活，但這尚不能充分闡明其耐藥機(jī)制。Tarn等[3]的研究表明，發(fā)生甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥的GIST患者存在胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)基因擴(kuò)增的現(xiàn)象。而IGF-1R同屬于酪氨酸激酶受體，與配體結(jié)合后可引發(fā)下游信號通路的級聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。本研究采用IGF-1R抑制劑AG-1024干預(yù)甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST細(xì)胞，了解細(xì)胞凋亡相關(guān)生物學(xué)特性及其可能分子機(jī)制，為甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥的GIST患者的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 甲磺酸伊馬替尼購自愛必信(上海)生物科技有限公司(批號：abs817884)，GIST-T1細(xì)胞購自上海欽誠生物科技有限公司；胰酶(批號：Z9503)和胎牛血清(批號：10099141C)購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；IGF-1R抑制劑AG-1024購自美國Selleck Chemicals公司(批號：S1234)；蛋白激酶B(protein kinase B,Akt；批號：# 9272)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt；批號：# 9271)及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin；批號：# 5816)抗體購自Cell Signaling公司；聚偏二氟乙烯膜(批號：03010040001)購自Sigma-Aldrich公司；預(yù)染蛋白Marker購自上海鈺博生物科技有限公司(批號：YBD1084)；增強(qiáng)發(fā)光試劑盒購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司(批號：D003-1)。杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自Sigma-Aldrich公司公司(批號：56436C)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞的誘導(dǎo)和鑒定：將GIST-T1細(xì)胞系置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待GIST-T1細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，以終濃度為25 μmol/L的甲磺酸伊馬替尼作為起始濃度處理細(xì)胞，48 h后更換不含甲磺酸伊馬替尼的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%，傳代；待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后，更換含有終濃度為25 μmol/L的甲磺酸伊馬替尼的培養(yǎng)液處理48 h，如此反復(fù)直至GIST-T1細(xì)胞在含有終濃度為25 μmol/L的甲磺酸伊馬替尼的培養(yǎng)液中正常生長，再增加甲磺酸伊馬替尼濃度至終濃度為37.5 μmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥性，細(xì)胞穩(wěn)定生長后再逐漸增加甲磺酸伊馬替尼濃度至50 μmol/L直至細(xì)胞穩(wěn)定生長。檢測耐藥GIST-T1細(xì)胞的甲磺酸伊馬替尼半數(shù)抑制濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果顯示耐藥GIST-T1細(xì)胞的甲磺酸伊馬替尼半數(shù)抑制濃度為(48.4±1.9)μmol/L，高于野生型GIST-T1細(xì)胞的(11.2±0.75)μmol/L(t=89.986，P<0.001)。

1.2.2 AG-1024干預(yù)對甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞增殖活性的影響:用0.25%的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的甲磺酸伊馬替尼耐藥性GIST-T1細(xì)胞，用10%胎牛血清終止消化后，收集細(xì)胞以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5×104個(gè)/mL，接種于96孔板(每孔200 μL，含1×104個(gè)細(xì)胞)，置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，將細(xì)胞分為5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L AG-1024濃度組和對照組(不同AG-1024濃度組采用200 μL二甲亞砜溶解制成相應(yīng)濃度AG-1024)，對照組添加等體積的二甲亞砜。取l孔作為空白調(diào)零孔(加培養(yǎng)基100 μL、四甲基偶氮唑鹽10 μL、二甲亞砜100 μL)，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培12 h、24 h、48 h后，向每孔加入10 μL四甲基偶氮唑鹽溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 AG-1024干預(yù)對甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞Akt、p-Akt核蛋白表達(dá)的影響:取對數(shù)生長期的伊馬替尼耐藥GIST-T1細(xì)胞置于24孔板中，將細(xì)胞分為AG-1024 12 h組、AG-1024 24 h組、AG-1024 48 h組和對照組，AG-1024干預(yù)組加入0.2 μL終濃度為10 μmol/L AG-1024，對照組添加等體積的二甲亞砜。分別干預(yù)12 h、24 h、48 h后收集AG-1024干預(yù)組(對照組于干預(yù)即刻收集細(xì)胞)等量細(xì)胞(2×105個(gè))，按照細(xì)胞核提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：SN0020)說明書操作步驟提取細(xì)胞核蛋白。順序加入裂解緩沖液及試劑乙醇液，冰上研磨細(xì)胞；將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，4℃，2 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞核沉淀，裂解緩沖液重懸；重懸液加入培養(yǎng)基緩沖液中，4℃，2 500 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞核沉淀；裂解緩沖液重懸細(xì)胞核沉淀，3 000 r/min，離心10 min，收集細(xì)胞核沉淀；用適量的Store Buffer重懸細(xì)胞核沉淀；最后，加入上樣緩沖液裂解細(xì)胞核，用Bradford法測定蛋白濃度。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，取50 ng蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗工作液(Akt、p-Akt抗體及β-肌動(dòng)蛋白抗體稀釋度均為1 ∶1 000)，4℃孵育過夜后加入二抗(1 ∶5 000)，室溫?fù)u床孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影后用UVP凝膠圖像處理系統(tǒng)LabWorks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測方差分析進(jìn)行比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AG-1024對甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞增殖的影響 時(shí)間與分組具有交互效應(yīng)(F交互=58.683,P交互<0.001)；吸光度值有隨時(shí)間變化的趨勢(F時(shí)間=102.706，P時(shí)間<0.001)，其中各濃度AG-1024組的吸光度值呈下降趨勢；4組細(xì)胞吸光度值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=124.315，P組間<0.001)，同一時(shí)間點(diǎn)，各濃度AG-1024組的吸光度值均低于對照組，且10 μmol/L與20 μmol/L AG-1024組的吸光度值低于5 μmol/L AG-1024組(均P<0.05)，但10 μmol/L與20 μmol/L AG-1024組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1?？紤]到藥物的作用濃度在一定程度上與細(xì)胞毒性呈正相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選用10 μmol/L AG-1024這一濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 4組伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞吸光度值的比較(x±s)

2.2 AG-1024對甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞Akt、p-Akt蛋白表達(dá)水平的影響 對照組與各AG-1024干預(yù)組Akt蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且AG-1024干預(yù)組不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)Akt蛋白表達(dá)水平比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；各AG-1024干預(yù)組p-Akt蛋白表達(dá)水平均低于對照組，AG-1024 12 h組、AG-1024 24 h組、AG-1024 48 h組細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表2和圖1。

表2 4組甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s)

圖1 4組甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞Akt和p-Akt蛋白表達(dá)情況

3 討 論

20世紀(jì)80年代，Mazur等[5]最早將這種缺乏平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和神經(jīng)鞘瘤免疫組織化學(xué)特征的非上皮腫瘤稱為“胃腸間質(zhì)瘤”。隨著研究的深入，人們逐漸對GIST的發(fā)生和發(fā)展有了新的認(rèn)識。Hirota等[6]及Heinrich等[7]分別于1998年及2003年報(bào)告了編碼酪氨酸激酶的c-kit及PDGFRA-α基因的突變在GIST發(fā)生發(fā)展過程中的作用,這為GIST的靶向治療提供了理論依據(jù)。

Joensuu等[2]首次采用甲磺酸伊馬替尼治療晚期GIST患者并取得了革命性的成果后，GIST患者的生存率得到顯著提高。但繼發(fā)性耐藥始終是困擾實(shí)體腫瘤藥物治療的難題，GIST亦不例外。因此，如何解決甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)性耐藥成為亟待解決的難題?，F(xiàn)階段研究顯示，甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)性耐藥的機(jī)制主要c-kit/PDGFRA基因的二次突變改變了c-kit構(gòu)造，使得甲磺酸伊馬替尼的結(jié)合位點(diǎn)被隱藏，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生[8]。但臨床上近半數(shù)的甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥的GIST患者并未檢測出新的突變位點(diǎn)[9]，提示二次突變理論并不能解釋所有的耐藥現(xiàn)象，可能存在其他酪氨酸激酶受體的活化而導(dǎo)致甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥的發(fā)生。

IGF-1R同屬于酪氨酸激酶受體，在人類許多惡性腫瘤中存在過表達(dá)，其與配體相結(jié)合后引發(fā)胞內(nèi)區(qū)多個(gè)酪氨酸的自我磷酸化，從而激活下游相關(guān)信號通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡的作用[10]。本研究結(jié)果顯示，IGF-1R抑制劑AG-1024能明顯抑制甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞的增殖，且隨著作用時(shí)間的延長其抑制作用增加(P<0.05)，提示在一定濃度范圍內(nèi)AG-1024對甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥GIST-T1細(xì)胞增殖具有抑制作用，且有一定的時(shí)間依賴性。但當(dāng)AG-1024藥物濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)，兩者對細(xì)胞增殖的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

黃穎鵬等[11]的研究結(jié)果顯示，對于甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥性的GIST患者，即使無c-kit/PDGFRA二次突變，繼發(fā)性耐藥GIST患者組織標(biāo)本中仍存在IGF-1R基因及蛋白水平的表達(dá)上調(diào)，證實(shí)IGF-1R介導(dǎo)的信號通路在c-kit/PDGFRA二次突變之外的耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。研究表明，Akt蛋白處于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy-linositol 3-kinase，PI3K)/Akt信號通路的中心位置，經(jīng)磷酸化后被激活形成p-Akt，后者進(jìn)一步使多個(gè)Akt下游蛋白發(fā)生磷酸化(包括PI3K)，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡等[12]。周楠等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R抑制劑NVP-AEW541可以通過失活PI3K/Akt信號通路，下調(diào)Akt的磷酸化水平，進(jìn)而抑制SKOV3-PKH26hi細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)AG-1024干預(yù)后，在Akt蛋白表達(dá)水平無明顯變化前提下，隨著干預(yù)時(shí)間的延長，p-Akt蛋白表達(dá)水平逐漸下調(diào)(P<0.05)。這提示IGF-1R抑制劑AG-1024可通過抑制甲磺酸伊馬替尼繼發(fā)耐藥GIST-T1細(xì)胞的PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化，從而起到抑制細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，AG-1024可抑制伊馬替尼繼發(fā)耐藥性GIST-T1細(xì)胞的增殖,且呈一定的時(shí)間依賴性，抑制PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化可能是其作用機(jī)制之一。