景文祥，喻 莉，劉 歡，余 英

1. 宜賓林竹產(chǎn)業(yè)研究院，四川 宜賓 644000；2. 西南科技大學 材料科學與工程學院，四川 綿陽 621000；3. 四川中電福溪電力開發(fā)有限公司，四川 宜賓 645100；4. 四川威爾檢測技術股份有限公司，四川 成都 610041

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino），草本攀援類植物，又名“五葉參”、“七葉膽”，含有多種與人參皂苷相同的成分[1-3]，具有益氣健脾、化痰止咳、清熱解毒的功效[4-5]。絞股藍茶采用絞股藍葉腋部位的嫩芽和龍須制備，茶湯碧綠，味清香、微苦，入喉回甘。絞股藍茶中含有豐富的皂苷及微量元素[6]，具有降“三高”、延緩衰老、調(diào)節(jié)脂肪代謝、抗癌[7]等作用，因此深受大眾喜愛[8-10]。

硒（Se）在自然界中以無機硒和有機硒兩種狀態(tài)存在[11]，在人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)機體免疫、血糖、血脂、抗氧化、心血管、視力等生理活性。當人體內(nèi)含有較高的血硒水平和較低的血硒水平均會導致一些疾病。硒在人體內(nèi)安全范圍較窄，僅差1 ～ 2個數(shù)量級[12-13]。故對于食品中硒含量的準確、高效、簡便分析方法及不確定度的評定在生產(chǎn)和食品安全上具有很高的價值。目前，茶葉中硒含量的測定標準采用GB/T 5009.93—2017，采用濕法或微波進行消解結合ICP-MS法[14]、熒光分光光度法[15]、原子熒 光法[16-17]進行定量分析，但由于消解及趕酸溫度、時間等條件憑經(jīng)驗判斷，具有不確定性，導致結果不能精確控制。本試驗以絞股藍茶為研究對象，采用微波消解——原子熒光法測定其中硒的含量，優(yōu)化了儀器分析條件并進行了不確定度的評定，可為絞股藍茶企業(yè)及相關檢測機構提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍茶購自平利縣百草堂生物科技有限公司。硒標準溶液，GSB G62029—90（3401），購自國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院。生物質成分分析標準物質芹菜，GBW10048（GSB-26），購自地球物理地球化學勘察研究所。

鹽酸（GR），重慶川東化工（集團）有限公司；硝酸（GR）、鐵氰化鉀（AR）、氫氧化鉀（GR）、硼氰化鉀（GR）、鐵氰化鉀（AR），均購自成都市科隆化工試劑廠；實驗用水為實驗室自制超純水，電阻率≥18.25 MΩ·cm。

1.2 儀器與設備

PF6-1型原子熒光分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；AR124CN型電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；WX-8000型微波消解儀，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；G-160型智能控溫電加熱器，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；實驗室常用玻璃量器均為A級且檢定合格，使用前經(jīng)1∶5（V/V）的硝酸-水溶液浸泡12 h以上。

1.3 實驗方法與不確定度評定

1.3.1 樣品消解

稱取一定質量的樣品（精確至0.0001 g）于消解管中，加入5 mL硝酸，加蓋過夜，然后進行微波消解。待樣品消解完全、冷卻、排氣后，將消解管置于智能控溫電加熱器中，一定溫度下加熱至近干，再加 5 mL 的 6 mol/L HCl-H2O溶液，繼續(xù)加熱至溶液呈現(xiàn)清亮無色或略微泛黃，放置冷卻，用水多次洗滌消解管，合并洗滌液至 25 mL 容量瓶中，加入 6.25 mL 的 10 g/L K3[Fe(CN)6]-H2O溶液，用水定容，搖勻，備用。同時按上述方法制備空白試劑3份[18-20]。

1.3.2 儀器檢測條件

按一定的負高壓、燈電流（主燈電流、輔燈電流設定值相同，下同）、載液濃度、還原劑（硼氰化鉀堿液）濃度、載氣流速、屏蔽氣流速下進行測定，讀數(shù)時間12 s，延遲時間3 s，原子化器溫度200℃，爐高8 mm，載液第一次進樣量1.5 mL，載液第二次進樣量1.5 mL，樣品進樣量1.0 mL，采用自動進樣方式，測定波長為196.0 nm，計算方式為峰面積，平行測定3次取平均值，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 硒元素標準曲線的繪制

100 μg/mL硒的標準溶液：精確吸取1.00 mL 的 1000 μg/mL 硒的標準溶液于 10 mL 容量瓶中，5 %（V/V）的鹽酸-水溶液定容，混勻。

1 μg/mL 硒的標準溶液：精確吸取 1.00 mL的100 μg/mL硒的標準溶液于100 mL容量瓶中，5 %（V/V）的鹽酸-水溶液定容，混勻。

硒元素標準曲線：分別取1 μg/mL的硒的標準溶液 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL 于 100 mL 容量瓶中，加入 100 g/L的 K3[Fe(CN)6]-H2O 溶液 10 mL，用 5 %（V/V）鹽酸-水溶液定容，混勻，待測。

1.3.4 數(shù)學模型的建立和不確定度來源分析

絞股藍茶中硒的含量X按公式（1）計算[21-22]

式中：X—絞股藍茶中硒的含量，mg/kg；c —待測液中硒含量，ng/mL；V—待測樣品定容體積，mL；m—絞股藍茶稱樣質量，g；f—稀釋倍數(shù)。

影響絞股藍茶中硒含量測定結果的不確定度來源[23-25]及評定見表1。

表1 不確定度來源及評定方法Table 1 Source of uncertainty and method of evaluation

2 結果與分析

2.1 絞股藍茶中硒含量的測定

2.1.1 微波消解升溫程序優(yōu)化

由于現(xiàn)行標準GB/T 5009.93—2017在消解、趕酸時溫度、時間等條件憑現(xiàn)象及經(jīng)驗，具有一定的不穩(wěn)定性，故筆者通過試驗對微波消解過程及趕酸過程進行了優(yōu)化，當升溫程序按照表2設定，消解完成后在170℃條件下加熱至近干時，消解時間最短，溶液澄清透明，效果最好，回收率較高。

表2 微波消解程序Table 2 Procedure of microwave digestion

2.1.2 負高壓對硒元素熒光值的影響

按照1.3.2設定儀器檢測條件，將負高壓分別設定為 230 V、250 V、270 V、290 V、310 V，燈電流為50 mA，載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶 液，還原劑為8 g/L硼氰化鉀堿溶液（稱取8 g 硼氰化鉀溶解于1 L的5 g/L的KOH-H2O溶液中，下同），載氣流速為400 mL/min，屏蔽氣流速為 600 mL/min，在該條件下測定 0.75 ng/mL 硒的標準溶液，平行測定三次，結果取平均值，結果如圖1所示。

圖1 負高壓對熒光值的影響Figure 1 Effect of negative high voltage on fluorescence value

由圖1可知，隨著電壓的增加，熒光值明顯加強，當負高壓大于290 V時，由于儀器測量噪聲明顯導致樣品峰形不穩(wěn)定[26]，重現(xiàn)性良好，故本實驗負高壓選擇270V。

2.1.3 燈電流對硒元素熒光值的影響

按照1.3.2設定儀器檢測條件，將燈電流分別設定為 30 mA、35 mA、40 mA、45 mA、50 mA，負高壓為270 V，載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶液，還原劑為8 g/L的硼氰化鉀堿溶液，載氣流速為400 mL/min，屏蔽氣流速為600 mL/min，在該條件下測定0.75 ng/mL硒的標準溶液，平行測定三次，結果取平均值，結果如圖2所示。

由圖 2可知，燈電流在 30 ～ 45 mA 范圍內(nèi)熒光值隨燈電流的增大快速升高，當燈電流大于45 mA后趨于穩(wěn)定，過高的燈電流會縮短硒燈的壽命，重現(xiàn)性良好，故本實驗燈電流選擇45 mA。

圖2 燈電流對熒光值的影響Figure 2 Effect of lamp current on fluorescence value

2.1.4 載氣流速對硒元素熒光值的影響

按照1.3.2設定儀器檢測條件，將載氣流速分別設定為 100 mL/min、200 mL/min、300 mL/min、400 mL/min、500 mL/min、600 mL/min、700 mL/min、800 mL/min，負高壓為 270 V，燈電流為50 mA，載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶液，還原劑為8 g/L的硼氰化鉀堿溶液，屏蔽氣流速為 600 mL/min，在該條件下測定 0.75 ng/mL 硒的標準溶液，平行測定三次，結果取平均值，結果如圖3所示。

由圖3可知，載氣流速越大對硒元素氫化物的推動作用越大，熒光值越高，當載氣流量在 300 ～ 600 mL/min 時，熒光值較為穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。實驗中可以觀察到由于載氣流量過大，硒元素氫化物氣液分離效果變差，造成熒光值不穩(wěn)定，故本實驗載氣流速選擇400 mL/min。

圖3 載氣流速對熒光值的影響Figure 3 Effect of flow rate of carrier gas on fluorescence value

2.1.5 屏蔽氣流速對硒元素熒光值的影響

按照1.3.2設定儀器檢測條件，將屏蔽氣流速 分 別 設定 為 200 mL/min、400 mL/min、600 mL/min、700 mL/min，負高壓為 270 V，燈電流為50 mA，載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶液，還原劑為8 g/L硼氰化鉀堿溶液，載氣流速為400 mL/min，在該條件下測定 0.75 ng/mL 硒的標準溶液，平行測定三次，取平均值，結果如圖4所示。

圖4 屏蔽氣流速對熒光值的影響Figure 4 Effect of flow rate of shield gas on fluorescence value

由圖4可知，屏蔽氣流速對熒光值影響呈先上升后下降趨勢，但屏蔽氣流速范圍在200 ～ 700 mL/min范圍內(nèi)，熒光值變化范圍不大，重現(xiàn)性良好。故本實驗屏蔽氣流速選擇600 mL/min。

2.1.6 載液濃度對硒元素熒光值的影響

按照1.3.2設定儀器檢測條件，將載液鹽酸-水溶液濃度分別設定為2 %（V/V，下同）、4 %、5 %、8 %、9 %，負高壓為 270 V，燈電流為 50 mA，載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶液，還原劑為8 g/L硼氰化鉀堿溶液，載氣流速為400 mL/min，屏蔽氣流速為600 mL/min，在該條件下測定0.75 ng/mL硒的標準溶液，平行測定三次，取平均值，結果如圖5所示。

圖5 載液濃度對熒光值的影響Figure 5 Effect of concentration of carrier liquid on fluorescence value

由圖5可知，由于低濃度的酸與還原劑反應溫和，且空白值較小，所以隨著載液濃度的增加，熒光值先緩緩上升，當濃度大于5 %后，由于空白值變大，實驗穩(wěn)定性下降，熒光值急速下降。實驗重現(xiàn)性良好，故本實驗載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶液。

2.1.7 還原劑濃度對硒元素熒光值的影響

按照1.3.2設定儀器檢測條件，還原劑為硼氰化鉀堿液，濃度分別設定為4 g/L（配置溶液的堿液及定容的溶液均為5 g/L的KOH-H2O溶液，下同）、6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、 16 g/L，負高壓為 270 V，燈電流為 50 mA，載液為5 %（V/V）鹽酸-水溶液，載氣流速為400 mL/min，屏蔽氣流速為 600 mL/min，在該條件下測定0.75 ng/mL硒的標準溶液，平行測定三次，取平均值，結果如圖6所示。

由圖6可知，隨著還原劑中硼氰化鉀濃度增加，熒光值逐漸升高，但硼氫化鉀濃度超過10 g/L時，產(chǎn)生H2量過大，氣液分離效果變差，可以看到部分液滴通過管道進入爐體，實驗穩(wěn)定性下降。實驗重現(xiàn)性良好，故實驗還原劑為10 g 硼氰化鉀 / L (5 g/L KOH-H2O)溶液。

圖6 還原劑濃度對熒光值的影響Figure 6 Effect of concentration of reductant on fluorescence value

2.1.8 標準曲線范圍、靈敏度及檢出限

按照1.3.3中方法配置系列標準溶液，進行測定，以硒濃度（x）為橫坐標，熒光值（y）為縱坐標，繪制標準曲線如圖7所示。

圖7 硒的標準曲線Figure 7 The standard curve of selenium

硒標液濃度范圍為0 ～ 5 ng/mL，硒標液濃度吸光度標準曲線方程為：y = 36.7791x+0.9248，R2= 0.9994。根據(jù)食品衛(wèi)生檢驗方法測定并計 算[27]，檢出限為0.07956 μg/L，標線重現(xiàn)性良好。

2.1.9 方法精密度、準確度及重現(xiàn)性

平行稱取 0.5 g（精確至 0.0001 g）絞股藍茶6份，按照1.3.1中方法進行消解，同時進行全溶劑空白及生物質成分分析標準物質芹菜進行消解，取1、2、3、4、5、6號樣品置于25 mL容量瓶中，分別加入25 ng/mL硒標準溶液0 mL、 0 mL、0 mL、0.85 mL、1.70 mL、3.40 mL 混勻、定容，每組樣品平行測定10次，測定值取平均值，結果見表3。

表3 方法精密度、準確度及重現(xiàn)性測定結果 (n=10)Table 3 Determination results of precision, accuracy and repeatability of the method (n=10)

通過計算，該方法測定絞股藍茶中硒的回收率范圍為 93.45 % ～ 99.98 %，相對標準偏差RSD 范圍為 0.60 % ～ 1.74 %。通過 1 ～ 3 號三次平行消解后測定結果較為接近，絞股藍茶葉中硒的平均值為0.08325 mg/kg，證明該分析方法是穩(wěn)定的，具有可重復性。同時，用該方法 測定標準物質芹菜中硒含量為0.117 mg/kg，認定證書中查閱芹菜中硒含量認定值為（0.118± 0.017） mg/kg，芹菜的測定值在推薦值（真實值）范圍內(nèi)，準確性高，符合分析實驗要求。

2.2 絞股藍茶中硒含量測定的不確定度評定

2.2.1 樣品前處理引入的不確定度urelsam

樣品消解引入的不確定度urelsam(v)。25 mL容量瓶帶來的不確定度urelsam(v)1：根據(jù)常用玻璃量器檢定規(guī)程[28]，定容樣品的25 mL容量（A級），為B類評定，最大允許誤差±0.03 mL，按均勻分布計算，usam(v)1= 0.03/31/2= 0.01732 mL。所以相對不確定度 urelsam(v)1= usam(v)1/V= 0.0006928。

溫度引起體積變動帶來的不確定度urelsam(v)2。 假設水溫為(20±3) ℃，此時水的膨脹系數(shù)為2.1× 10-4℃-1，按均勻分布計算，usam(v)2=體積×膨脹系 數(shù) ×ΔT/k = 25×2.1×10-4×3/31/2= 0.009093 mL。 所以相對不確定度urelsam(v)2= usam(v)2/V= 0.0003637。

2.2.2 標準儲備液配置及標準曲線擬合引起的不確定度urelstd

標準儲備液引入的不確定度urelstd1。實驗所用硒的標準溶液證書標注擴展不確定度為4 μg/mL，即區(qū)間半寬度a = 4，為B類評定，按照均勻分布計算，所以其相對標準不確定度urelstd1=a/k/體積 = 4/31/2/1000 = 0.002309。

標準溶液配置引入的不確定度urelstd2。配置系列標準溶液時，使用到1 mL吸量管、10 mL容量瓶、100 mL容量瓶，均為A級，為B類評定，按均勻分布計算，使用次數(shù)及相對標準不確定度urelstd2-x，以1 mL吸量管的相對標準不確定度為例，urelstd2-1mL=容量允差/31/2/量程= 0.008/31/2/1 = 0.004619，結果見表 4。

表4 標準溶液配置容量器具引入的不確定度Table 4 Results of uncertainty of standard solution configuration volumetric apparatus

使用 1 mL 吸量管、10 mL 容量瓶、100 mL 容量瓶移取、定容溶液時，由于溫度引起體積變動，屬于B類評定，按均勻分布計算，故溫度引起體積變動的相對不確定度urelstd2-T = 2.1×10-4×3/31/2= 0.009093。

所以標準溶液配置的相對不確定度為urelstd2=

標準曲線擬合引入的不確定度urelstd3。按照1.3.3方法配置標準溶液，擬合出標準曲線方程 為y= 36.7791x+0.9248，R2= 0.9994， 即a= 36.7791，b= 0.9248。標準曲線各點平均測定3次，即 N = 18，樣品重復測定 10 次，即p= 10。待測樣品中硒濃度平均值= 1.6613 ng/mL。擬合曲線的相對不確定度計算公式urelstd3見公式（2），中間計算結果見表5。

表5 標準曲線及中間計算結果Table 5 Standard curve and intermediate calculation results

式中：s—擬合曲線的偏差；a—斜率；p—樣品重復的次數(shù)，次；N—擬合曲線上的點總個數(shù)，個；—樣品濃度的平均值，ng/mL；—標準曲 線濃度的平均值，ng/mL；—標準曲線上第i或j點濃度值，ng/mL；—標準曲線上第j點的實測熒光值。

所以標準曲線擬合的相對不確定度urelstd3= 0.01329。

2.2.3 測定過程中的隨機效應引入的不確定度urelrep

2.2.4 絞股藍茶中硒含量的合成不確定度ucom

2.2.5 絞股藍茶中硒含量的擴展不確定度U及報告結果

根據(jù)擴展不確定度公式U = k×ucom，取包含概率約為95 %，故k = 2，所以絞股藍茶中硒含量的擴展不確定度 U = 0.003 mg/kg。

根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）報告結果：原子熒光法測定絞股藍茶中硒含量為 (0.083±0.003) mg/kg；k = 2。

3 結論與討論

研究通過優(yōu)化儀器檢測時的負高壓、燈電流、載液濃度、還原劑濃度、載氣流速、屏蔽氣流速等條件，分析了樣品前處理、標準儲備液配置及標準曲線擬合、測定過程中的隨機效應等方面引入的不確定度，綜合分析得到如下結論：

儀器檢測參數(shù)的最優(yōu)檢測條件為：負高壓270 V、燈電流（主燈電流、輔燈電流設定值相同）45 mA、載液為5%（V/V）的HCl-H2O溶液、還原劑為 10 g 硼氰化鉀 / L（5 g/LKOH-H2O）溶液、載氣流速400 mL/min、屏蔽氣流速600 mL/min下進行測定，讀數(shù)時間12 s，延遲時間3 s，原子化器溫度200℃，爐高8 mm，載液第一次進樣量1.5 mL，載液第二次進樣量1.5 mL，樣品進樣量1.0 mL，采用自動進樣方式，測定波長為 196.0 nm。在該條件下，硒在 0 ～ 5 ng/mL的范圍內(nèi)，濃度和熒光值線性關系良好R2= 0.9994，檢出限為0.07956 μg/L，相對標準偏差RSD 范圍為 0.60 % ～ 1.74 %，加標回收率范圍為 93.45 % ～ 99.98 %。三次獨立平行實驗結果較為接近，重現(xiàn)性良好，絞股藍茶葉中硒的平均值為0.08325 mg/kg。用該方法同時測定的標準物質芹菜中硒的測定值為0.117 mg/kg，認定證書中查閱芹菜中硒含量認定值為0.118±0.017 mg/kg。

原子熒光法測定絞股藍茶中硒含量為（0.083±0.003）mg/kg；k = 2。研究證明與 GB/T 5009.93—2017相比，采用微波消解—原子熒光法測定絞股藍中硒含量方法具有高效、準確、重復性好、操作簡便的特點。在測定絞股藍茶中硒含量的過程中，標準曲線擬合是影響合成不確定度最大的來源，在檢測過程中應注意加強對標準曲線質量的控制，降低檢測過程對結果準確性的影響，提高測量精度。本試驗結果能夠為絞股藍茶生產(chǎn)廠家硒含量測定與分析提供技術指導，對第三方檢測、食品、環(huán)境等行業(yè)具有借鑒意義。