盧聲潔，趙興麗，羅林麗，程宇豪，張金峰，李 帥，周玉鋒*

1. 貴州大學 茶學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省農業(yè)科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006；3. 貴州省農業(yè)科學院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006

茶樹是我國傳統(tǒng)經濟作物，其經濟價值主要集中于葉片。茶輪斑病（Tea grey blight）是茶樹栽培中最為常見的一類葉部病害，可危害不同時期的茶樹葉片；初期在葉片上形成灰色或褐色病斑，后期可導致葉片枯死脫落，嚴重時甚至引發(fā)整株茶樹死亡，給茶葉生產帶來較大經濟損失[1-3]。前人研究發(fā)現，茶輪斑病主要由類擬盤多毛孢（Pesta lotiopsis-like）即原擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis Steyaert真菌侵染引起[4-5]；目前，已報道的病原長剛毛擬盤多毛孢（Pestalotiopsis longiseta）、茶擬盤多毛孢（P. theae）、山茶擬盤多毛孢（P. camelliae）、棒形新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）、山龍眼新擬盤多毛孢（N. protearum）、茶假擬 盤 多 毛 孢（Pseudopestalotiopsis camelliaesinensis）等16余種[6-9]。由于引起茶輪斑病的擬盤多毛孢屬真菌種類較多, 且不同種間生物學特性存在差異，給茶輪斑病病害的防治帶來困難。因此，明確該病致病菌種類和致病力是指導茶輪斑病防治的基礎。

在早期茶樹病害研究中，多以采用傳統(tǒng)形態(tài)學特征結合致病性的方法對其病原進行鑒別和區(qū)分[10-11]，但由于類擬盤多毛孢屬真菌種間關系較為復雜，不同培養(yǎng)條件下菌落形態(tài)、分生孢子大小及顏色等均可能存在一定差異，給病原準確分類造成一定難度[12]。近年來，隨著分子分類技術在物種劃分中的廣泛應用, 形態(tài)學特征結合致病性和多基因序列分析成為茶輪斑病病原鑒定的主要方法[13-15]。本研究為明確發(fā)生在貴州省湄潭縣茶葉所資源圃中的茶輪斑病致病病原，采用單孢分離法對致病菌進行分離純化，結合形態(tài)學觀察、致病力測定以及分子生物學方法綜合鑒定病原種類，以期為該地區(qū)病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：健康茶樹葉片采自貴州省農科院茶葉所資源圃，品種為福鼎大白茶。罹病葉片采自貴州省湄潭縣茶葉所資源圃，品種為福鼎大白茶。

培養(yǎng)基：PDA和WA培養(yǎng)基的配制參照文獻[16]。

1.2 方法

1.2.1 病原病菌分離純化

采用單孢分離法對田間采回的罹病葉片進行病原分離。體視鏡視野下找到病葉上的子實體，將注射器針頭灼燒2 ～ 3次后，挑取子實體放入盛有少量滅菌水的陶瓷點滴板中充分破碎，制成分生孢子懸浮液，用滅菌膠頭滴管將其吹打均勻后吸取一定量的懸浮液滴于皿底劃有網格線并加有鏈霉素（50 μg/mL）的2%的水瓊脂（WA）培養(yǎng)基平板上，室溫靜置培養(yǎng)12 h后挑取萌發(fā)的單個孢子接種到新鮮的PDA平板，于25℃條件下黑暗培養(yǎng)5 d。得到純化的菌株后，轉管保存。

1.2.2 病原致病性測試

采用針刺法對離體茶樹葉片進行致病性測試。選取新鮮且大小一致無病斑無傷口的茶樹葉片，經75%酒精表面消毒后置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿內，用無菌注射器分別對茶樹葉片正面和背面進行針刺處理，無菌接種針挑取5 mm的病原菌菌餅貼于傷口處，以接種無菌PDA為對照，恒溫保濕培養(yǎng)，每天觀察并記錄其發(fā)病情況，待病斑上產生子實體后再次挑取子實體分離致病菌。

1.2.3 病原鑒定

形態(tài)學觀察：將分離所得菌株接種于PDA平板上培養(yǎng) 5 ～ 7 d，觀察其培養(yǎng)性狀；待產孢后挑取少量菌絲及分生孢子于鏡下拍照觀察，描述菌落形態(tài)、繁殖體孢子等形態(tài)特征。

分子鑒定：采用Ezup柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA，并以所提基因組DNA為模板，利用引物ITS5/ITS4(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ )、Bt2a/Bt2b（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′/5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）、EF1-526F/EF1-1567R（5′-GTCGTYGTYA TYGGHCAYGT-3′/5′-ACHGTRCCRATA CCACCRATCTT-3′）對菌株的基因組DNA進行PCR 擴增[17]。反應體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，dd H2O 9.5 ul，上游引物、下游引物和DNA模板各1 μL。ITS擴增程序為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；β-tubulin擴增程序為：95℃預變性4 min，94℃變性48 s，57℃退火50 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min；tef1擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性18s， 54℃退火33 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量后，送生工生物工程 (上海) 有限公司測序。將測序結果與從 GenBank中下載公認菌株或模式菌株對應的基因序列用BioEdit進行比對和校正，利用 MAGA 6.0軟件將三條基因序列按ITS、β-tubulin和tef1的順序連接起來，比對拼接后的序列采用鄰接法（N-J）構建系統(tǒng)進化樹，確定該菌與同屬菌株間的親緣 關系。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離與純化結果

從具典型輪紋病斑的茶樹病葉上分離獲得一株茶輪斑病菌ZYP04-5，經3次續(xù)代培養(yǎng)后，得到純菌落，斜面和水保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病原菌的致病性

對茶樹葉片正反面進行針刺處理，接種ZYP04-5菌株4 d后可見葉片發(fā)生明顯棕褐色病變，且有病菌菌絲穿透針刺部位附著在葉片上（圖1B ～ 圖1C）。葉片正面針刺處理發(fā)病程度快于背面針刺處理，而對照（圖1A）和無刺傷處理（未體現）均無明顯現象。當培養(yǎng)時間延長至9 d后，正面針刺處理病斑擴大至葉緣，而背面針刺處理病斑擴散不明顯，此時病斑由初期的棕褐色轉為中部黃褐、邊緣黑褐色輪紋狀并有少量棕褐色子實體排列成輪紋狀附著在病斑上（圖1D ～ 圖1E）。挑取病斑子實體進行鏡檢和單孢分離培養(yǎng)，可獲得與原接種菌株ZYP04-5形態(tài)特征基本一致的分生孢子和菌落。

圖1 葉片正反面接種形成的病斑及顯微特征Figure 1 Morphological characteristics of disease spots formed by inoculation on both sides of leaves

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定結果

在PDA上，25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d后菌株ZYP04-5菌落可鋪滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，菌落白色至乳白色，背面白色，棉絮狀，邊緣整齊，具輪紋，輪紋由內向外呈放射狀（圖2A ～ 圖2B）；在菌落中央可形成半流動狀黑色黏液團，接種針挑取一點制成水玻片于顯微鏡下觀察，可發(fā)現產孢細胞在產孢初期時較長，直立狀（圖2C）；中期分生孢子膨大，燒瓶狀或啤酒瓶狀（圖2D ～ 圖2F），淡色或無色；后期分生孢子紡錘形，大小約為（18.20 ～ 29.96）μm×（4.23 ～ 6.73）μm，具有 4隔膜 5細胞，分隔處向內稍微縊縮，中間橫隔明顯；分生孢子兩端細胞呈錐形，無色；中間3細胞異色，長約為 12.13 ～ 17.63 μm，呈甕狀至近圓柱形；基部向上第二細胞淺褐色或橄欖綠色，三、四細胞深褐色或深橄欖綠色；頂端具2 ～ 3根附屬絲，長約為 11.1 ～ 22.7 μm；基部附屬絲 1 根，長約為 1.92 ～ 6.37 μm。根據形態(tài)學特征，初步將該菌鑒定為新擬盤多毛孢Neopestalotiopsis spp.屬真菌。

圖2 菌株ZYP04-5的形態(tài)特征Figure 2 Morphological characteristics of strain ZYP04-5

2.4 分子鑒定結果

PCR分別擴增基因組DNA的ITS、β-tubulin和 tef1片段，大小分別為 580 bp、480 bp和1010 bp，經BLAST比對分析后選取并下載序列相似性高的菌株為內群，P. trachicarpicola為外群（表1）；用BioEdit進行多位點序列比對并對其進行手動校正，MAGA 6.0軟件拼接相應序列片段后構建ZYP04-5的鄰接樹（圖3）。結果表明，菌株ZYP04-5以86%的支持率與N.ellipsospora聚為一枝，結合該菌株形態(tài)學特征分析，確定菌株ZYP04-5為卵圓新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis ellipsospora）。

圖3 基于ITS、β-tubulin和tef1構建鄰接樹Figure 3 Adjacency tree construction based on multi-locus sequences of ITS、β-tubulin 和 tef1

表1 所用的菌株情況Table 1 Strains used in this study

3 討論

類擬盤多毛孢（Pestalotiopsis-like）屬真菌為弱寄生性真菌，據報道該屬真菌可侵染50多科植物發(fā)病[12]。傳統(tǒng)上對該屬真菌進行分類主要以依據分生孢子顏色和大小、附屬絲長度和數量等來進行區(qū)分。2014年，Maharachchikumbura結合ITS、β-tubulin和tef三基因加合分析結果，將擬盤多毛孢屬真菌按分生孢子顏色同色、同色且顏色較深和異色將其分成3個主要的進化枝，即Pestalotiopsis屬、Pseudopestalotiopsis屬和Neopestalotiopsis屬[18]。本文報道的菌株分生孢子形態(tài)即屬于第三個類群，形態(tài)學特征結合多基因聯(lián)合分析將分離自貴州省遵義市湄潭縣茶葉所資源圃中的茶輪斑病病原鑒定為卵圓新擬盤多毛孢（N.ellipsospora）。

國內外關于N.ellipsospora引起植物病害的報道較少, 僅在茶樹、五加葉、莎葉蘭和甘薯等一些經濟作物上有相關報道[19-21]，而關于N.ellipsospora在茶樹上的研究，Wang等[7]從采自浙江和四川的茶輪斑病病葉中分離到6株N.ellipsospora，但未對該菌的致病性進行分析；Wang等[22]從采自安徽廬江的茶輪斑病病葉中分離到2株N.ellipsospora，經柯赫氏驗證，該菌對10個茶樹品種的葉片均不致病，因此推測其可能是茶樹內生菌或腐生菌。本研究為確定從茶輪斑病病葉上分離的菌株是否能侵染茶樹葉片，采用柯赫氏法則探討了菌株ZYP04-5對茶樹的侵染情況，結果表明該菌株能夠侵染茶樹引起茶輪斑病，研究結果可為茶輪斑病的防治提供一定的理論依據。