周羅娜,陳銀翠,周玉鋒*,趙興麗,盧聲潔,劉 輝*,羅林麗,賀圣凌
1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/貴州省農(nóng)業(yè)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550006;2.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025;3.貴州大學(xué) 茶學(xué)院,貴州 貴陽 550025
木霉菌(Trichoderma spp.)可產(chǎn)生一系列對(duì)植物病原菌有拮抗作用的生物活性物質(zhì),提高農(nóng)作物的抗逆性,有效控制植物病害發(fā)生[1-2]并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。木霉菌的生物防控及促生作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)。李松鵬等[3]研究發(fā)現(xiàn)兩株能夠防治水稻紋枯病及促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的哈茨木霉菌,陸淼等[4]研究發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)甜瓜幼苗有促生作用及對(duì)甜瓜蔓枯病病原菌有抑制效果的木霉菌,馬賽等[5]研究發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)大白菜有促生作用及對(duì)根腫病有防治效果的哈茨木霉菌,趙玳琳等[6]研究了棘孢木霉GYSW-6 mL對(duì)草莓炭疽病的生防機(jī)制及其防病促生作用。在田間應(yīng)用上,徐培培[7]等研究發(fā)現(xiàn),在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上,每667 m2添加哈茨木霉菌劑4 kg可減少水稻田20%的肥料用量,且水稻產(chǎn)量可比常規(guī)施肥增加,并減少水稻稻曲病、紋枯病的發(fā)生;盧德鵬等[8]通過田間試驗(yàn)檢測(cè)得到木霉菌水分散粒劑(1×108cfu/g)對(duì)小麥紋枯病的防治效率可達(dá)71.59%,小麥增產(chǎn)率為16.8%;趙遠(yuǎn)征[9]等研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉可濕性粉劑、木霉菌·促生芽孢桿菌顆粒劑對(duì)馬鈴薯黑痣病均有防治效果和增產(chǎn)效果,且木霉菌·促生芽孢桿菌顆粒劑的防治效率最高可達(dá)76.33%,增產(chǎn)17.50%。以上研究均表明,木霉菌劑開發(fā)與使用能夠有效減少作物化肥、農(nóng)藥的施用。本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到了一株對(duì)茶炭疽病菌有較好拮抗作用的木霉菌[10-11],但此菌株對(duì)茶樹是否具有促生作用還未明確。
本研究通過盆栽試驗(yàn),測(cè)定木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)(株高、根長(zhǎng)、根重)、葉綠素總量、MDA摩爾質(zhì)量濃度和酶活性(PPO、POD、PAL)的影響,以明確該木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗的促生作用。以期為木霉菌新型生物制劑的開發(fā)利用與茶產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展奠定基礎(chǔ),達(dá)到茶園“雙減”效果。
1.1.1 菌株
木霉菌(Trichoderma asperelloides):由本實(shí)驗(yàn)室分離保存,對(duì)茶炭疽病菌有拮抗作用。
1.1.2 種子
福鼎大白茶茶樹種子,采自貴州省農(nóng)科院茶園。
1.1.3 培養(yǎng)基
PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL。
PDB培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水 1000 mL。
發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖18.34 g、酵母浸膏1.88 g、磷酸氫二鉀0.86 g、硫酸亞鐵0.63 g、蒸餾水 1000 mL。
1.2.1 木霉菌發(fā)酵液的制備
平板活化:在PDA培養(yǎng)基上接種直徑5 mm木霉菌菌餅,28℃ 恒溫培養(yǎng),培養(yǎng)7 d。
種子液培養(yǎng):在500 mL錐形瓶中裝 100 mL PDB培養(yǎng)基,從平板上挑取菌落接種于搖瓶中,培養(yǎng)溫度 28℃,搖床轉(zhuǎn)速120 r/min,培養(yǎng) 3 d后進(jìn)行接種發(fā)酵。
發(fā)酵培養(yǎng):在 500 mL 錐形瓶中裝 100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,向培養(yǎng)基中接種1%的種子液,培養(yǎng)溫度 28℃,搖床轉(zhuǎn)速 120 r/min,培養(yǎng) 7 d。
發(fā)酵液制備:發(fā)酵完成后,將發(fā)酵液經(jīng)抽濾去除菌絲后即得試驗(yàn)用發(fā)酵液。
1.2.2 木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗的促生試驗(yàn)
茶樹種子消毒:選取大小均一、顆粒飽滿的福鼎大白茶茶樹種子,放入3%次氯酸鈉中浸泡1 min進(jìn)行表面消毒,消毒完成后用清水將茶種表面清洗干凈。
茶樹種子催芽:使用40℃~ 60℃溫水將表面消毒完成的茶樹種子浸泡48 h(每8 h換一次水)。浸泡完成后,將茶樹種子放入濕潤(rùn)的蛭石中,25℃條件下進(jìn)行催芽。
茶苗灌根處理:待茶苗長(zhǎng)出約1 cm時(shí),將長(zhǎng)勢(shì)相近的茶苗移栽到盛有營(yíng)養(yǎng)土的育苗盤中,進(jìn)行灌根處理。將發(fā)酵液制備成原液、稀釋50倍、稀釋150倍等3種濃度,用注射器分別吸取制備好的發(fā)酵液 20 mL,在移栽后的 0 d、5 d、10 d、15 d注入土中,同時(shí)注入等量的水作為對(duì)照(CK)。
在灌根處理后的20 d,分別測(cè)量株高、根長(zhǎng)、根重。并測(cè)定葉綠素總量、過氧化物酶、多酚氧化酶、丙二醛濃度、苯丙氨酸降解酶的活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。
1.2.3 物質(zhì)含量和酶活性的測(cè)定
物質(zhì)含量和酶活性測(cè)定方法:葉綠素總量采用乙醇提取-比色法[12]、丙二醛MDA采用硫代巴比妥酸法、多酚氧化酶PPO采用鄰苯二酚法、苯丙氨酸解氨酶PAL采用苯丙氨酸比色法、過氧化物酶POD采用愈創(chuàng)木酚法。過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、丙二醛的測(cè)定均使用上海索橋生物科技有限公司的試劑盒。
2.1.1 根長(zhǎng)與根重
由表1可知,不同濃度的發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗進(jìn)行灌根處理20 d后,根長(zhǎng)、根重差異較明顯。其中,木霉菌發(fā)酵原液對(duì)茶樹幼苗的根長(zhǎng)、根重具有抑制作用;木霉菌發(fā)酵液稀釋50倍液和稀釋150倍后,對(duì)茶樹幼苗的根長(zhǎng)、根重均有促進(jìn)作用(圖1);當(dāng)木霉菌發(fā)酵液稀釋50倍時(shí)促生作用最為明顯,相比CK,根長(zhǎng)增加40.4%,根重增加 61.70%(P< 0.05)。
表1 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的 茶樹幼苗根長(zhǎng)與根重Table 1 Root length and root weight of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
2.1.2 株高
由表2可知,木霉菌發(fā)酵原液、稀釋150倍液處理后的茶樹幼苗的株高,相對(duì)CK差異不顯著。木霉菌發(fā)酵原液對(duì)株高稍有抑制作用,稀釋150倍液稍有促進(jìn)作用,稀釋50倍液的株高明顯高于CK(圖1),增加量達(dá)12.57%。
表2 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗株高Table 2 Plant height of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
圖1 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗生長(zhǎng)情況Figure 1 Growth of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
2.2.1 葉綠素總量
由表3可知,不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理茶樹幼苗20 d后,對(duì)茶樹葉片的葉綠素總量影響不同。稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液條件下茶樹幼苗的葉綠素總量比對(duì)照增加14.71%,原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的葉綠素總量減少。
表3 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的 茶樹幼苗葉綠素總量Table 3 Total chlorophyll content of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
2.2.2 丙二醛(MDA)摩爾質(zhì)量濃度
由圖2可知,用不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理茶樹幼苗20 d后,MDA摩爾質(zhì)量濃度較CK均有所下降,下降幅度為1.77%~27.93%。當(dāng)木霉菌發(fā)酵液稀釋50倍時(shí),MDA摩爾質(zhì)量濃度下降最為明顯,較對(duì)照降低了27.93%(P< 0.05)。
圖2 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗MDA摩爾質(zhì)量濃度Figure 2 MDA molar mass concentration of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
2.2.3 多酚氧化酶(PPO)活性
由圖3可知,木霉菌發(fā)酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的PPO酶活性顯著降低, 稀釋50倍液使茶樹幼苗的PPO酶活性顯著增高,較對(duì)照 CK 增加 31.47%(P< 0.05)。
圖3 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗PPO活性Figure 3 PPO activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
2.2.4 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性
由圖4可知,木霉菌發(fā)酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的PAL酶活性降低,但不顯著;稀釋50倍液使茶樹幼苗的PAL酶活性顯著增高,較對(duì)照增加 10.64%(P< 0.05)。
圖4 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗PAL活性Figure 4 PAL activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
2.2.5 過氧化物酶(POD)活性
由圖5可知,木霉菌發(fā)酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的POD酶活性降低,稀釋50倍液使茶樹幼苗的POD酶活性增高,比對(duì)照CK增加4.21%,增加幅度不顯著。
圖5 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗POD活性Figure 5 POD activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth
本試驗(yàn)以對(duì)茶樹炭疽病菌有拮抗作用的一株木霉菌為試驗(yàn)菌株,通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定其發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗的促生作用。結(jié)果表明,使用稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗進(jìn)行灌根處理20 d后,茶樹幼苗的株高、根長(zhǎng)和根重增長(zhǎng)明顯,增幅分別達(dá)12.57%、40.40%和61.70%。
通過測(cè)定茶樹幼苗葉片葉綠素總量、MDA摩爾質(zhì)量濃度以及PPO、POD、PAL酶活性,可以得出,經(jīng)稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液灌根處理20 d后的茶樹幼苗,葉綠素總量明顯增加,增幅為 14.71%(P < 0.05);MDA 摩爾質(zhì)量濃度明顯降低,降幅為 27.93%(P < 0.05);PPO、POD、PAL酶活性增高,增幅分別為31.47%(P < 0.05)、10.64%(P < 0.05)和 4.21%。
葉綠素是影響植物光合作用過程的重要色素,葉綠素含量的多少直接影響植物體光合作用的強(qiáng)弱和植物體有機(jī)物的合成與積累[13]。在本試驗(yàn)中,稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液處理過的茶樹幼苗葉綠素總量與對(duì)照比較明顯增加,有利于茶樹幼苗物質(zhì)的量的積累,可為后期提升茶葉產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。
PPO作為植物體內(nèi)重要的氧化酶,可將多酚物質(zhì)直接氧化為醌類物質(zhì)形成保護(hù)性屏蔽使植物細(xì)胞免受病菌的侵害,發(fā)揮抗病作用;同時(shí)醌類化合物參與合成木質(zhì)素,促進(jìn)細(xì)胞壁的木質(zhì)化,抵抗病原菌的侵染。木質(zhì)素是植物抵抗病原菌侵入和擴(kuò)散的重要防衛(wèi)手段,POD催化脂肪族、芳香族和酚類的氧化,是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一[14],POD酶活性與植物的抗病性密切相關(guān)。PAL作為苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、防紫外線輻射、抵御病蟲害方面起著重要的作用。PAL活性與植物抗病性呈正相關(guān),可作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)[15-16]。本試驗(yàn)中,PPO、POD、PAL酶活性均有所增加,結(jié)果說明稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液可提高茶樹幼苗的抗病性。其中茶樹PPO酶活性的增加,可增加茶葉的風(fēng)味,提高茶葉品質(zhì)[17-18]。
MDA作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的最主要終產(chǎn)物,可以反應(yīng)植物細(xì)胞中膜脂過氧化程度,MDA濃度與膜脂過氧化程度呈正相關(guān),MDA濃度越高,說明細(xì)胞中膜脂過氧化程度越高,細(xì)胞膜損害越嚴(yán)重。本試驗(yàn)中,經(jīng)稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液灌根處理20 d后的茶樹幼苗MDA濃度明顯降低。此結(jié)果說明稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液明顯降低了茶樹幼苗的細(xì)胞膜過氧化程度,增加了茶樹幼苗對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的抗逆性,此結(jié)果與PPO、POD、PAL酶活性結(jié)果相一致。
以上結(jié)果是通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)證明的,田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步研究。