周羅娜，陳銀翠，周玉鋒*，趙興麗，盧聲潔，劉 輝*，羅林麗，賀圣凌

1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/貴州省農(nóng)業(yè)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550006；2.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 茶學(xué)院，貴州 貴陽 550025

木霉菌（Trichoderma spp.）可產(chǎn)生一系列對(duì)植物病原菌有拮抗作用的生物活性物質(zhì)，提高農(nóng)作物的抗逆性，有效控制植物病害發(fā)生[1-2]并促進(jìn)植物生長(zhǎng)。木霉菌的生物防控及促生作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)。李松鵬等[3]研究發(fā)現(xiàn)兩株能夠防治水稻紋枯病及促進(jìn)水稻生長(zhǎng)的哈茨木霉菌，陸淼等[4]研究發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)甜瓜幼苗有促生作用及對(duì)甜瓜蔓枯病病原菌有抑制效果的木霉菌，馬賽等[5]研究發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)大白菜有促生作用及對(duì)根腫病有防治效果的哈茨木霉菌，趙玳琳等[6]研究了棘孢木霉GYSW-6 mL對(duì)草莓炭疽病的生防機(jī)制及其防病促生作用。在田間應(yīng)用上，徐培培[7]等研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)施肥的基礎(chǔ)上，每667 m2添加哈茨木霉菌劑4 kg可減少水稻田20%的肥料用量，且水稻產(chǎn)量可比常規(guī)施肥增加，并減少水稻稻曲病、紋枯病的發(fā)生；盧德鵬等[8]通過田間試驗(yàn)檢測(cè)得到木霉菌水分散粒劑（1×108cfu/g）對(duì)小麥紋枯病的防治效率可達(dá)71.59%，小麥增產(chǎn)率為16.8%；趙遠(yuǎn)征[9]等研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉可濕性粉劑、木霉菌·促生芽孢桿菌顆粒劑對(duì)馬鈴薯黑痣病均有防治效果和增產(chǎn)效果，且木霉菌·促生芽孢桿菌顆粒劑的防治效率最高可達(dá)76.33%，增產(chǎn)17.50%。以上研究均表明，木霉菌劑開發(fā)與使用能夠有效減少作物化肥、農(nóng)藥的施用。本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到了一株對(duì)茶炭疽病菌有較好拮抗作用的木霉菌[10-11]，但此菌株對(duì)茶樹是否具有促生作用還未明確。

本研究通過盆栽試驗(yàn)，測(cè)定木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)（株高、根長(zhǎng)、根重）、葉綠素總量、MDA摩爾質(zhì)量濃度和酶活性（PPO、POD、PAL）的影響，以明確該木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗的促生作用。以期為木霉菌新型生物制劑的開發(fā)利用與茶產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展奠定基礎(chǔ)，達(dá)到茶園“雙減”效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

木霉菌（Trichoderma asperelloides）：由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，對(duì)茶炭疽病菌有拮抗作用。

1.1.2 種子

福鼎大白茶茶樹種子，采自貴州省農(nóng)科院茶園。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水 1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18.34 g、酵母浸膏1.88 g、磷酸氫二鉀0.86 g、硫酸亞鐵0.63 g、蒸餾水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌發(fā)酵液的制備

平板活化：在PDA培養(yǎng)基上接種直徑5 mm木霉菌菌餅，28℃ 恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d。

種子液培養(yǎng)：在500 mL錐形瓶中裝 100 mL PDB培養(yǎng)基，從平板上挑取菌落接種于搖瓶中，培養(yǎng)溫度 28℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng) 3 d后進(jìn)行接種發(fā)酵。

發(fā)酵培養(yǎng)：在 500 mL 錐形瓶中裝 100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接種1%的種子液，培養(yǎng)溫度 28℃，搖床轉(zhuǎn)速 120 r/min，培養(yǎng) 7 d。

發(fā)酵液制備：發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液經(jīng)抽濾去除菌絲后即得試驗(yàn)用發(fā)酵液。

1.2.2 木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗的促生試驗(yàn)

茶樹種子消毒：選取大小均一、顆粒飽滿的福鼎大白茶茶樹種子，放入3%次氯酸鈉中浸泡1 min進(jìn)行表面消毒，消毒完成后用清水將茶種表面清洗干凈。

茶樹種子催芽：使用40℃～ 60℃溫水將表面消毒完成的茶樹種子浸泡48 h（每8 h換一次水）。浸泡完成后，將茶樹種子放入濕潤(rùn)的蛭石中，25℃條件下進(jìn)行催芽。

茶苗灌根處理：待茶苗長(zhǎng)出約1 cm時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)相近的茶苗移栽到盛有營(yíng)養(yǎng)土的育苗盤中，進(jìn)行灌根處理。將發(fā)酵液制備成原液、稀釋50倍、稀釋150倍等3種濃度，用注射器分別吸取制備好的發(fā)酵液 20 mL，在移栽后的 0 d、5 d、10 d、15 d注入土中，同時(shí)注入等量的水作為對(duì)照（CK）。

在灌根處理后的20 d，分別測(cè)量株高、根長(zhǎng)、根重。并測(cè)定葉綠素總量、過氧化物酶、多酚氧化酶、丙二醛濃度、苯丙氨酸降解酶的活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 物質(zhì)含量和酶活性的測(cè)定

物質(zhì)含量和酶活性測(cè)定方法：葉綠素總量采用乙醇提取-比色法[12]、丙二醛MDA采用硫代巴比妥酸法、多酚氧化酶PPO采用鄰苯二酚法、苯丙氨酸解氨酶PAL采用苯丙氨酸比色法、過氧化物酶POD采用愈創(chuàng)木酚法。過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、丙二醛的測(cè)定均使用上海索橋生物科技有限公司的試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)茶樹幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.1.1 根長(zhǎng)與根重

由表1可知，不同濃度的發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗進(jìn)行灌根處理20 d后，根長(zhǎng)、根重差異較明顯。其中，木霉菌發(fā)酵原液對(duì)茶樹幼苗的根長(zhǎng)、根重具有抑制作用；木霉菌發(fā)酵液稀釋50倍液和稀釋150倍后，對(duì)茶樹幼苗的根長(zhǎng)、根重均有促進(jìn)作用（圖1）；當(dāng)木霉菌發(fā)酵液稀釋50倍時(shí)促生作用最為明顯，相比CK，根長(zhǎng)增加40.4%，根重增加 61.70%（P< 0.05）。

表1 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的 茶樹幼苗根長(zhǎng)與根重Table 1 Root length and root weight of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.1.2 株高

由表2可知，木霉菌發(fā)酵原液、稀釋150倍液處理后的茶樹幼苗的株高，相對(duì)CK差異不顯著。木霉菌發(fā)酵原液對(duì)株高稍有抑制作用，稀釋150倍液稍有促進(jìn)作用，稀釋50倍液的株高明顯高于CK（圖1），增加量達(dá)12.57%。

表2 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗株高Table 2 Plant height of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

圖1 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗生長(zhǎng)情況Figure 1 Growth of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2 對(duì)茶樹幼苗物質(zhì)含量和酶活性的影響

2.2.1 葉綠素總量

由表3可知，不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理茶樹幼苗20 d后，對(duì)茶樹葉片的葉綠素總量影響不同。稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液條件下茶樹幼苗的葉綠素總量比對(duì)照增加14.71%，原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的葉綠素總量減少。

表3 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的 茶樹幼苗葉綠素總量Table 3 Total chlorophyll content of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.2 丙二醛（MDA）摩爾質(zhì)量濃度

由圖2可知，用不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理茶樹幼苗20 d后，MDA摩爾質(zhì)量濃度較CK均有所下降，下降幅度為1.77%～27.93%。當(dāng)木霉菌發(fā)酵液稀釋50倍時(shí)，MDA摩爾質(zhì)量濃度下降最為明顯，較對(duì)照降低了27.93%（P< 0.05）。

圖2 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗MDA摩爾質(zhì)量濃度Figure 2 MDA molar mass concentration of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性

由圖3可知，木霉菌發(fā)酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的PPO酶活性顯著降低， 稀釋50倍液使茶樹幼苗的PPO酶活性顯著增高，較對(duì)照 CK 增加 31.47%（P< 0.05）。

圖3 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗PPO活性Figure 3 PPO activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

由圖4可知，木霉菌發(fā)酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的PAL酶活性降低，但不顯著；稀釋50倍液使茶樹幼苗的PAL酶活性顯著增高，較對(duì)照增加 10.64%（P< 0.05）。

圖4 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗PAL活性Figure 4 PAL activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.5 過氧化物酶（POD）活性

由圖5可知，木霉菌發(fā)酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的POD酶活性降低，稀釋50倍液使茶樹幼苗的POD酶活性增高，比對(duì)照CK增加4.21%，增加幅度不顯著。

圖5 不同濃度木霉菌發(fā)酵液處理后的茶樹幼苗POD活性Figure 5 POD activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以對(duì)茶樹炭疽病菌有拮抗作用的一株木霉菌為試驗(yàn)菌株，通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定其發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗的促生作用。結(jié)果表明，使用稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液對(duì)茶樹幼苗進(jìn)行灌根處理20 d后，茶樹幼苗的株高、根長(zhǎng)和根重增長(zhǎng)明顯，增幅分別達(dá)12.57%、40.40%和61.70%。

通過測(cè)定茶樹幼苗葉片葉綠素總量、MDA摩爾質(zhì)量濃度以及PPO、POD、PAL酶活性，可以得出，經(jīng)稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液灌根處理20 d后的茶樹幼苗，葉綠素總量明顯增加，增幅為 14.71%（P < 0.05）；MDA 摩爾質(zhì)量濃度明顯降低，降幅為 27.93%（P < 0.05）；PPO、POD、PAL酶活性增高，增幅分別為31.47%（P < 0.05）、10.64%（P < 0.05）和 4.21%。

葉綠素是影響植物光合作用過程的重要色素，葉綠素含量的多少直接影響植物體光合作用的強(qiáng)弱和植物體有機(jī)物的合成與積累[13]。在本試驗(yàn)中，稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液處理過的茶樹幼苗葉綠素總量與對(duì)照比較明顯增加，有利于茶樹幼苗物質(zhì)的量的積累，可為后期提升茶葉產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

PPO作為植物體內(nèi)重要的氧化酶，可將多酚物質(zhì)直接氧化為醌類物質(zhì)形成保護(hù)性屏蔽使植物細(xì)胞免受病菌的侵害，發(fā)揮抗病作用；同時(shí)醌類化合物參與合成木質(zhì)素，促進(jìn)細(xì)胞壁的木質(zhì)化，抵抗病原菌的侵染。木質(zhì)素是植物抵抗病原菌侵入和擴(kuò)散的重要防衛(wèi)手段，POD催化脂肪族、芳香族和酚類的氧化，是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一[14]，POD酶活性與植物的抗病性密切相關(guān)。PAL作為苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、防紫外線輻射、抵御病蟲害方面起著重要的作用。PAL活性與植物抗病性呈正相關(guān)，可作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)[15-16]。本試驗(yàn)中，PPO、POD、PAL酶活性均有所增加，結(jié)果說明稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液可提高茶樹幼苗的抗病性。其中茶樹PPO酶活性的增加，可增加茶葉的風(fēng)味，提高茶葉品質(zhì)[17-18]。

MDA作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的最主要終產(chǎn)物，可以反應(yīng)植物細(xì)胞中膜脂過氧化程度，MDA濃度與膜脂過氧化程度呈正相關(guān)，MDA濃度越高，說明細(xì)胞中膜脂過氧化程度越高，細(xì)胞膜損害越嚴(yán)重。本試驗(yàn)中，經(jīng)稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液灌根處理20 d后的茶樹幼苗MDA濃度明顯降低。此結(jié)果說明稀釋50倍的木霉菌發(fā)酵液明顯降低了茶樹幼苗的細(xì)胞膜過氧化程度，增加了茶樹幼苗對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的抗逆性，此結(jié)果與PPO、POD、PAL酶活性結(jié)果相一致。

以上結(jié)果是通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)證明的，田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步研究。