谷美儀，宋發(fā)如，田 娜，黃建安,3，劉仲華,3，劉碩謙,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙410128；3. 教育部茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128

茶樹短穗扦插因操作簡單且成本不高，成為優(yōu)良植株無性繁殖的重要方式[1]。茶樹扦插發(fā)根主要受扦插基質(zhì)、扦插時(shí)間、扦插溫度、外源激素、茶樹品種等因素的影響，目前大部分研究主要在土培扦插的基礎(chǔ)上優(yōu)化土壤、水分等條件，以提高茶樹短穗扦插的生根率，加快插穗生根速度[2-5]。盛忠雷[6]研究表明適宜福鼎大白茶扦插枝條生長的最佳土壤溫度在21℃～30℃，六個(gè)月后生根率可達(dá)到36%左右。吳淑平等[5]研究發(fā)現(xiàn)用泥炭土加泥沙土做處理使茶樹插穗生根最快，9個(gè)月后生根率達(dá)到71.1%。柴紅玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)在適宜的生根劑濃度下，不同外源激素對扦插苗的生長具有一定的促進(jìn)作用，其中NAA對插穗生根率影響最大，大約5個(gè)月后生根率可達(dá)60%～70%。

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)考察基質(zhì)組成、環(huán)境溫度、植物生長調(diào)控劑等因素對茶樹插穗生根效率的影響。在此基礎(chǔ)之上，采用響應(yīng)面分析法分析各因素之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建茶樹插穗生根效率的數(shù)學(xué)模型，以期獲得茶樹插穗最佳生根培養(yǎng)條件，為縮短茶苗繁育周期、降低育苗成本、提高茶樹良種推廣速度提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

采穗母本為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所母本園中3齡碧香早茶樹，選擇生命力旺盛的當(dāng)年生、2/3以上半木質(zhì)化枝條，沿斜角45°剪下，保持上端切口平整，插穗不破裂，插穗長度約為4～5 cm，人工氣候箱中培養(yǎng)，每天14 h的光照，光照強(qiáng)度15000 lx，空氣相對濕度保持85%。

1.2 試驗(yàn)試劑

生根劑SGJ1、SGJ2、SGJ3、SGJ4和SGJ5， 由本實(shí)驗(yàn)室配制，主要成分NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚乙酸）、GA（赤霉素）、2,4-D（二氯苯氧乙酸）和柳樹新梢提取物。五種生根劑各成分配比分別為7∶2∶1∶0∶10、7∶1.5∶1∶0.5∶10、5∶1∶1∶0.5∶12.5、3∶1∶1∶0.5∶14.5和3 ∶1 ∶0.5 ∶0.5 ∶15。

1.3 單因素試驗(yàn)

考察基質(zhì)含沙量（沙土比）、溫度、生根劑種類、生根劑濃度、生根劑處理時(shí)間等因素對茶樹插穗生根的影響，每組設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，每組處理插穗60株。

1.3.1 含沙量影響試驗(yàn)

將黃心土和不同比例的河沙混合，含沙量分別為30%～100%，環(huán)境溫度24℃。

1.3.2 溫度影響試驗(yàn)

扦插基質(zhì)為含沙量70%的黃土，溫度分別設(shè)為 14℃～30℃。

1.3.3 生根劑種類影響試驗(yàn)

每組生根劑分別為試劑SGJ1、SGJ2、SGJ3、SGJ4和SGJ5，扦插基質(zhì)為含沙量70%的黃土，生根劑濃度50 mg/L，環(huán)境溫度24℃。

1.3.4 生根劑濃度影響試驗(yàn)

采用生根劑SGJ3，每組濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L 、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L和80 mg/L。扦插基質(zhì)為含沙量70%的黃土，環(huán)境溫度24℃。

1.3.5 生根劑處理時(shí)間影響試驗(yàn)

采用50 mg/L的SGJ3生根劑分別處理茶樹插穗切口 1～13 min（各處理以 1 min 為單位遞增），扦插基質(zhì)為含沙量70%的黃土，環(huán)境溫度24℃。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以茶樹插穗生根率（Y）為響應(yīng)值，含沙量（A）,溫度（B），生根劑濃度（C）和處理時(shí)間（D）為試驗(yàn)因素進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面分析[8]。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定茶樹插穗最佳生根條件，其試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The response surface test factors level

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL2019和Design-Expert.v8.0.6.1進(jìn)行繪圖、統(tǒng)計(jì)分析與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 含沙量對茶樹插穗生根率的影響

結(jié)果表明（圖1），在含沙量30%～70%茶樹插穗生根率顯著升高，且生根率在不同含沙量之間呈極顯著差異。當(dāng)含沙量為70%時(shí)，曲線達(dá)到最高點(diǎn)，生根率8周內(nèi)達(dá)到52.22%。隨含沙量增加，70%～100%含沙量生根率不具有顯著差異，生根率則趨于平緩，略有下降。因此，選用含沙量70%的河沙和黃心土混合基質(zhì)較為適宜。

圖1 含沙量對茶樹插穗生根率的影響Figure 1 Effects of sand content on rooting rate of tea cuttings

2.1.2 溫度對茶樹插穗生根率的影響

結(jié)果表明（圖2），當(dāng)溫度為14℃時(shí)插穗生根率最低，生根率為9.44%。后隨溫度升高，生根率急劇上升。當(dāng)溫度為24℃時(shí)，生根率達(dá)到最高值，同最低、最高溫之間存在顯著差異，8周內(nèi)生根率為53.33%。但當(dāng)溫度高于24℃時(shí)，隨溫度上升生根率反而下降。

圖2 溫度對茶樹插穗生根率的影響Figure 2 Effect of temperature on rooting rate of tea cuttings

2.1.3 生根劑種類對茶樹插穗生根率的影響

不同的生根劑效果相差顯著，結(jié)果如圖3所示。其中生根劑SGJ3作用效果最顯著，生根率同其他生根劑存在顯著差異，茶樹插穗生根率最高，3周內(nèi)達(dá)到73.33%；而生根劑SGJ2作用最低,插穗生根率僅為31.67%。

圖3 不同生根劑對茶樹插穗生根率的影響Figure 3 Effects of different rooting agent on rooting rate of tea cuttings

2.1.4 生根劑濃度對茶樹插穗生根率的影響

結(jié)果表明（圖4），生根劑濃度在10～50 mg/L，各濃度間存在顯著差異，插穗生根率直線上升。50 mg/L時(shí)達(dá)到最高，生根率3周內(nèi)可達(dá)73.33%。后隨濃度增加生根率逐步下降。因此，選用生根劑SGJ3濃度為50 mg/L較為適宜。

圖4 生根劑濃度對茶樹插穗生根率的影響Figure 4 Effects of rooting agent concentration on rooting rate of tea cuttings

2.1.5 處理時(shí)間對茶樹插穗生根率的影響

結(jié)果表明（圖 5），1～9 min 內(nèi)，生根率呈上升趨勢，當(dāng)切口處理時(shí)間為9 min時(shí)，插穗生根率達(dá)到最高，3周內(nèi)達(dá)到85.56%。但超過9 min后，生根率之間不具有顯著差異，且隨處理時(shí)間的增加生根率略有下降。因此，9 min為最佳處理時(shí)間。

圖5 處理時(shí)間對茶樹插穗生根率的影響Figure 5 Effect of treatment time on rooting rate of tea cuttings

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化茶樹插穗生根條件

2.2.1 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見表2。采用Design-Expert.V8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，建立多元二次方程如下：

Y=88.59-0.19A+0.0888-0.19C+0.51D+ 0.24A×B-0.085A×C-0.040A×D-0.19B×C-0.85B×D-0.19C×D-0.92A2-0.83B2-1.34C2-1.65D2。以茶樹插穗生根率為響應(yīng)值，根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，對生根條件模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface test

由表3可知，該模型極顯著（P< 0.0001）, 失擬項(xiàng)不顯著（P= 0.08 > 0.05）, 表明擬合狀況良好[9-10]。且方程決定系數(shù)R2=0.9841，CV = 0.24%，說明該模型可以解釋98.41%茶樹生根的變化，能很好反應(yīng)真實(shí)的茶樹插穗生根率。此外，信噪比 = 28.27 > 4，說明模型合理 ,試驗(yàn)可靠性高，可用于茶樹插穗生根最佳條件的確定。由表3還可知，因素A、C、D、A2、B2、C2、D2、AB、BD、CD均對茶樹插穗生根影響表現(xiàn)出了顯著水平。由方差F值可知，4個(gè)因素對生根率的影響程度為：處理時(shí)間（D）>含沙量（A）>生根劑濃度（C）>溫度（B）。

2.2.2 各因素及其交互作用分析

通過回歸模型，可以得到各因素之間交互作用對茶樹插穗生根率的等高線圖和響應(yīng)面立體分析圖。由圖6～圖11可直觀看出各因素間存在交互作用，其中處理時(shí)間對生根率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面陡峭；其次為含沙量和生根劑濃度，表現(xiàn)為曲線較平滑[11]，同表3分析結(jié)果吻合。

圖6 含沙量(A)與溫度(B)對茶樹插穗生根率的交互作用的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Figure 6 Response surface (left) and contour (right) of interaction between sand content (A) and temperature (B) on rooting rate of tea cuttings

圖7 含沙量(A)與生根劑濃度(C)對茶樹插穗生根率的交互作用的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Figure 7 Response surface (left) and contour (right) of interaction between sand content (A) and rooting agent concentration (C) on rooting rate of tea cuttings

圖8 含沙量(A)與處理時(shí)間(D)對茶樹插穗生根率的交互作用的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Figure 8 Response surface (left) and contour (right) of interaction between sand content (A) and soaking time (D) on rooting rate of tea cuttings

圖9 溫度(B)與生根劑濃度(C)對茶樹插穗生根率的交互作用的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Figure 9 Response surface (left) and contour (right) of interaction between temperature (B) and rooting agent concentration (C) on rooting rate of tea cuttings

圖10 溫度(B)與處理時(shí)間(D)對茶樹插穗生根率的交互作用的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Figure 10 Response surface (left) and contour (right) of interaction between temperature (B) and soaking time (D) on rooting rate of tea cuttings

圖11 生根劑濃度(C)與處理時(shí)間(D)對茶樹插穗生根率的交互作用的響應(yīng)面（左）和等高線（右）Figure 11 Response surface (lift) and contour (right) of interaction between rooting agent concentration (C) and soaking time (D) on rooting rate of tea cuttings

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert v8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)可得茶樹插穗生根最佳條件為：基質(zhì)含沙量69.45%、溫度23.89℃、生根劑濃度54.33mg/L、切口處理時(shí)間8.41 min，預(yù)測最佳生根率為88.66%。為驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性，按照最佳生根條件并綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際，將溫度參數(shù)修改為24℃，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，茶樹插穗實(shí)際平均3周生根率為88.4%，與模型預(yù)測值非常接近，說明根據(jù)此模型得到的最佳生根條件是可靠的。

本試驗(yàn)為了與常規(guī)方法比較，設(shè)對照試驗(yàn)（采用常規(guī)扦插方法，黃土基質(zhì)，未經(jīng)處理，室溫培養(yǎng)24℃），結(jié)果表明，第10周的生根率為83.6%、平均單株不定根數(shù)為2.7根。與常規(guī)方法相比，本試驗(yàn)建立的扦插方法大幅度縮短了育苗周期。此外，如圖12所示，單株插穗的不定根數(shù)量也明顯提高，單株不定根最多達(dá)到23根，平均單株的不定根數(shù)為5.9根，遠(yuǎn)高于常規(guī)方法。

圖12 部分茶樹插穗3周內(nèi)生根情況（左）和根數(shù)較多的部分插穗（右）Figure 12 Rooting of some tea cuttings within 3 weeks (left) and some cuttings with large number of roots (right)

3 討論

本試驗(yàn)考察了基質(zhì)組成、環(huán)境溫度、植物生長調(diào)控劑等因素對插穗生根效率的影響，在此基礎(chǔ)之上，采用響應(yīng)面分析法分析了各因素之間的相互作用關(guān)系,構(gòu)建了茶樹插穗生根效率的數(shù)學(xué)模型，獲得了茶樹插穗最佳生根的培養(yǎng)條件。

茶樹扦插基質(zhì)是決定扦插成功的關(guān)鍵, 土壤質(zhì)地疏松、通氣好, 扦插茶苗愈合發(fā)根快[12]。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)含沙量為70%的黃心土更利于茶樹插穗生根（圖1）。溫度對插穗的生根也有顯著影響，溫度在24℃時(shí)插穗生根率最高（圖2），其原因可能是因?yàn)榇藭r(shí)茶樹插穗生長代謝最活躍，促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)和生長素的合成及傳輸，增加可溶性蛋白和可溶性糖含量，從而有效促進(jìn)了根原基的形成[13-15]。低于或超過最適溫度時(shí)，酶活性較低，生根率逐漸下降。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，生根劑對加快茶樹插穗生根速度起到了決定作用，濃度為50 mg/L的生根劑SGJ3可以顯著加快茶樹插穗生根，將生根時(shí)間縮短到3周內(nèi)（80%以上的插穗形成了不定根，圖5）。本試驗(yàn)中使用的生根劑主要成分為柳樹新梢提取物，可能含有促進(jìn)植物組織生根的天然激素，從而有效促進(jìn)茶樹插穗生根。響應(yīng)面分析發(fā)現(xiàn)，各因素可協(xié)同影響茶樹插穗生根率，其中生根劑與基質(zhì)對茶樹插穗生根率的影響最大。另外，處理時(shí)間和濃度兩者間的交互作用呈極顯著（圖11）。張明澤等[16]通過植物激素研究可使茶樹插穗扦插5個(gè)月后生根率達(dá)到83.3%；孫緒聰?shù)萚17]研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)月后茶樹扦插條生根率達(dá)到91.16%。王雪萍[18]等人通過對溫度和光周期進(jìn)行調(diào)控縮短了茶樹插穗的生根時(shí)間，2個(gè)月后生根率達(dá)92.31%。本試驗(yàn)通過條件優(yōu)化，將88.4%的茶樹插穗生根時(shí)間縮短至3周內(nèi)，大幅度加快了茶樹插穗生根速度，提高了良種繁育效率。此外，在本試驗(yàn)的優(yōu)化條件下，單株茶樹插穗的不定根數(shù)也有了明顯的提高，茶苗根系更加發(fā)達(dá)，對提高茶苗移栽的成活率以及茶樹的抗性具有重要意義。

本試驗(yàn)研究顯著提高了茶樹插穗生根速度，對加速良種繁育、降低育苗成本有重要意義。但是，對于其促進(jìn)茶樹插穗生根的機(jī)理尚不完全清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。