李慧麗，劉雙紅，楊雪梅，黃嘉誠(chéng)，文衛(wèi)旗，陳紅旭，高憲云，唐 茜,3*

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2. 四川省名山茶樹良種繁育場(chǎng)，四川 雅安 625100；3.精制川茶四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130

四川茶樹品種資源豐富。李建華等[1]和王小萍等[2]研究發(fā)現(xiàn)，四川茶樹種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性與育種潛力，其中以滎經(jīng)枇杷茶、崇州枇杷茶、南江大葉茶、古藺牛皮茶這 4個(gè)地方資源尤為突出。唐建敏等[3-4]、黃福濤等[5]與李慧[6]分別研究了前三者的表型性狀和遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)三個(gè)種群內(nèi)變異及資源多樣性豐富，遺傳背景復(fù)雜，并從中培育出南江1號(hào)、云頂早、川茶5號(hào)等[7-9]茶樹新品種。但關(guān)于古藺牛皮茶的研究主要集中在野生牛皮茶群體上，種植品種均為群體種，性狀混雜，良莠不齊，推廣面積不足67 hm2，因此，開發(fā)利用野生牛皮茶資源，選育特異性狀新品系迫在眉睫。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以取自四川省名山茶樹良種繁育場(chǎng)的 24 個(gè)古藺牛皮茶新品系為研究材料，福鼎大白茶為對(duì)照（CK）；所有供試新品系（種）種植于同一塊地，樹齡均為 5 年，長(zhǎng)勢(shì)良好。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要生化成分測(cè)定

參照陳亮等[10]方法分別在春、夏、秋采摘24個(gè)新品系及對(duì)照的第1輪新梢一芽二葉制作生化樣，測(cè)定其茶多酚及兒茶素總量[11]、游離氨基酸總量[12]、咖啡堿[13]、水浸出物[14]；氨基酸組分和兒茶素組分送至中國(guó)測(cè)試研究生院生物所（成都）測(cè)試。

1.2.2 基于SSR標(biāo)記的遺傳多樣性

春季采摘24個(gè)品系新梢葉片，以錫箔紙包裹，放入液氮速凍，于-80℃ 冰箱中保存；從已發(fā)表的文獻(xiàn)中選取多態(tài)性好、條帶清晰、重復(fù)性高的10對(duì)SSR引物用于本試驗(yàn)[15-17]。樣品DNA提取選用植物基因組提取試劑盒（TIANGEN DP305）。擴(kuò)增結(jié)果中清晰條帶賦值為1，同一位置無帶或難以分辨的弱帶賦值為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。在同一擴(kuò)增位點(diǎn)，若有至少一個(gè)材料在該擴(kuò)增位點(diǎn)計(jì)數(shù)為“1”，則該擴(kuò)增位點(diǎn)為多態(tài)性條帶，每條多態(tài)性帶可視為一個(gè)等位基因。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)整理采用Excel 2013，基本數(shù)據(jù)分析及聚類分析采用SPSS 22.0進(jìn)行；聚類分析采用離差平方和法（Ward’s method），遺傳距離為平均歐氏距離[18]；遺傳多樣性分析和聚類用 POWERMARKER V3.25 進(jìn)行，計(jì)算供試材料的等位基因數(shù)（NA）、等位基因頻率（NE）、基因多樣性指數(shù)（I）、多態(tài)信息含量（PIC）等參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要生化成分含量

2.1.1 春夏梢主要生化成分含量

24個(gè)古藺牛皮茶新品系的春、夏梢水浸出物、游離氨基酸等主要生化成分分析結(jié)果表明（表1）， 12個(gè)新品系生化指標(biāo)的變異系數(shù)在3.63% ～ 27.88%，平均變異系數(shù)為11.54%，其中最大的為酚氨比（夏梢），最小的為水浸出物含量（春梢）。各品系間生化成分含量存在較大差異，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

表1 24個(gè)古藺牛皮茶新品系主要生化成分統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of main biochemical components of 24 new strains of Gulin Niupi tea

續(xù)表

24個(gè)新品系春、夏梢水浸出物含量較高，普遍高于對(duì)照（春梢15號(hào)、夏梢9號(hào)除外）；氨基酸總量方面，春梢中發(fā)現(xiàn)三個(gè)品系（6號(hào)、4號(hào)、1號(hào)）高于對(duì)照10%以上，而夏梢則普遍低于對(duì)照，其中5號(hào)、9號(hào)、14號(hào)顯著低于對(duì)照；茶多酚及兒茶素含量方面，春梢普遍高于對(duì)照，茶多酚總量有兩個(gè)品系高于對(duì)照34%以上，兒茶素含量則有三個(gè)品系高于對(duì)照44%以上；夏梢僅8號(hào)、23號(hào)的茶多酚含量略低于對(duì)照，其余品系茶多酚及兒茶素均高于對(duì)照，且茶多酚總量有三個(gè)品系高于對(duì)照 22%以上，兒茶素含量則有四個(gè)品系高于對(duì)照 20%以上；咖啡堿方面，春、夏梢咖啡堿含量變幅接近，均在3.10 ～ 4.50，春梢中有5個(gè)品系咖啡堿含量高于對(duì)照20%以上，而夏梢中高咖啡堿含量特征并不明顯，除17號(hào)、12號(hào)、8號(hào)以外均低于對(duì)照。

依上分析可知，24個(gè)牛皮茶新品系具選育高水浸出物、高EGCG和高咖啡堿等特色品種的潛力。

2.1.2 春夏梢酚氨比

24 個(gè)新品系春梢的酚氨比在 6.36 ～ 11.79，變異系數(shù)為14.39%；夏梢的酚氨比在9.04 ～ 25.26，變異系數(shù)為27.88%。一般認(rèn)為酚氨比小于8適制綠茶，大于15適制紅茶[19]，由此初步鑒定，牛皮茶1號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、20號(hào)、22號(hào)和23號(hào)的春梢適制綠茶，牛皮茶9號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、17號(hào)、18號(hào)和19號(hào)的夏梢適制紅茶。陳正武等根據(jù)前人研究和綜合實(shí)際分析認(rèn)為將酚氨比小于4.5和大于6.5分別作為判定適制綠茶和適制紅茶的標(biāo)準(zhǔn)更為科學(xué)[20]，如按照該標(biāo)準(zhǔn)， 則24個(gè)牛皮茶新品系中除了牛皮茶15號(hào)的春梢（酚氨比6.36±0.75）外，其他資源的春、夏梢均適制紅茶。

2.1.3 部分新品系春梢氨基酸組分

從24個(gè)新品系中選取春梢氨基酸含量較高（36.18 mg/g ～ 43.19 mg/g）的 6 個(gè)新品系進(jìn)行氨基酸組分測(cè)定（表2）。由表可知，牛皮茶6號(hào)的21種氨基酸總量最高，其次是牛皮茶4號(hào)和1號(hào)，分別比對(duì)照高21.42%、17.23%和16.11%；氨基酸組分中，天冬氨酸、谷氨酸、茶氨酸和精氨酸是構(gòu)成茶湯鮮味的重要成分[21]，8個(gè)新品系的四者總量為：牛皮茶6號(hào)（38.98 mg/g）> 1 號(hào)（37.57 mg/g）> 4 號(hào)（37.26 mg/g）> 13 號(hào)（34.04 mg/g）> 15 號(hào)（34.02 mg/g）> 10 號(hào)（32.97 mg/g）> CK（31.74 mg/g）。與滋味的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9223[22]的茶氨酸含量高低順序?yàn)榕Ｆげ?號(hào)> 4號(hào)> 1號(hào)>13號(hào)>15號(hào)>10號(hào)> CK，其中前三者分別比CK高22.17%、16.91%和16.07%。由此可以看出，牛皮茶1號(hào)、4號(hào)、6號(hào)具有加工綠茶滋味鮮爽的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 部分牛皮茶新品系春梢氨基酸組分分析Table 2 Analysis of amino acid composition in spring shoots of some new strains of Niupi tea

2.1.4 部分新品系春夏梢兒茶素組分

從24個(gè)供試新品系中選取春梢茶多酚和兒茶素含量較高的7個(gè)新品系進(jìn)行兒茶素組分測(cè)定（表3）。由于牛皮茶5號(hào)、12號(hào)、17號(hào)春、夏梢兒茶素總量均位居前三，因此進(jìn)一步測(cè)定此三者夏梢兒茶素組分。酯型兒茶素含量：牛皮茶 5 號(hào) > 12 號(hào) > 17 號(hào) > 8 號(hào) > 2 號(hào) > 19 號(hào) > 18號(hào)，顯著高于對(duì)照；進(jìn)一步關(guān)注酯型兒茶素的核心成分EGCG，發(fā)現(xiàn)其中牛皮茶5號(hào)、12號(hào)、17號(hào)的EGCG含量分別比對(duì)照高66.29%、61.03%和56.60%，同時(shí)這三個(gè)新品系的夏梢含量分別比對(duì)照高38.42%、30.16%和40.02%。

表3 部分新品系春夏梢的兒茶素組分分析Table 3 Analysis of catechin components in spring and summer shoots of some new strains of Niupi tea

2.2 遺傳多樣性

2.2.1 24份材料SSR擴(kuò)增結(jié)果

本試驗(yàn)中24份材料提取的DNA OD260/OD280 比值均在 1.71 ～ 1.87（標(biāo)準(zhǔn)為 1.7 ～ 1.9），DNA濃度均在232.1 ～ 485.2，提取的DNA質(zhì)量較好。用10對(duì)引物對(duì)24個(gè)古藺牛皮茶新品系進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，10對(duì)SSR引物擴(kuò)增效果良好，能夠得到清晰、易統(tǒng)計(jì)的條帶。

10個(gè)標(biāo)記共計(jì)240個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其中8個(gè)位點(diǎn)基因型缺失，可能的原因是PCR擴(kuò)增失敗或存在少數(shù)純和無效的等位基因[23]。10對(duì)引物共檢測(cè)到40個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因數(shù)4個(gè)，其中最多的為6個(gè)（A18、CS1058）， 最 少 的 為 3個(gè)（TM209、A114、TM237、TM052、TM169）；共檢測(cè)到69個(gè)基因型，平均每對(duì)引物檢測(cè)到6.9個(gè)基因型，其中最多的為14個(gè)（CS1058），最少為4個(gè)（A114）。群體內(nèi)遺傳多樣性分析結(jié)果等位基因頻率在0.354～0.870變動(dòng)，平均值為0.541；期望雜合度（He）在0.130 ～ 0.917浮動(dòng)，平均值為0.540，多態(tài)信息含量（PIC）在0.2272 ～ 0.7527變動(dòng)，平均值為0.5259；基因多樣性指數(shù)（H）在0.2372 ～ 0.7821變動(dòng)，平均值為0.5753（表4），結(jié)果表明24份古藺牛皮茶資源有較高的遺傳多樣性。

表4 24份牛皮茶資源遺傳多樣性分析Table 4 Analysis of genetic diversity of the 24 Niupi tea resources

2.2.2 基于SSR標(biāo)記的聚類分析

依據(jù)10對(duì)引物的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，用Power Marker V3.25 計(jì)算24個(gè)牛皮茶新品系間的Nei遺傳距離，結(jié)果顯示：24個(gè)牛皮茶新品系的遺傳距離變化范圍在0.0800 ～ 1.7984，其中遺傳距離最小的是牛皮茶20號(hào)和21號(hào)，遺傳距離最大的是牛皮茶6號(hào)和牛皮茶16號(hào)?；诟髌废甸g的遺傳距離，采用UPGMA法構(gòu)建聚類圖（圖2），遺傳距離為0.43時(shí)，可將24個(gè)牛皮茶新品系分為3個(gè)類群。類群Ⅰ包括牛皮茶6號(hào)和7號(hào)，牛皮茶18號(hào)單獨(dú)聚于類群Ⅱ，類群Ⅲ則包括其他21個(gè)新品系。

圖1 基于SSR分子標(biāo)記的聚類圖Figure 1 Cluster diagram based on SSR molecular markers

3 結(jié)論與討論

3.1 24個(gè)牛皮茶新品系生化成分多樣性

24個(gè)新品系的春、夏梢的游離氨基酸、咖啡堿、水浸出物、茶多酚、兒茶素總量 分 別 為 1.26%±0.04% ～ 4.46%±0.07%、3.11%±0.01% ～ 4.49%±0.03%、35.03%±0.20% ～ 47.81%±0.07%、27.24%±0.18% ～ 37.52%± 0.85%、17.13%±0.89% ～ 27.09%±0.61%，酚氨比在6.36 ～ 25.26。從水浸出物含量來看，有13個(gè)新品系春梢的水浸出物含量高于40%，所有品系夏梢全高于40%；表明這些新品系的內(nèi)含物豐富，所制成茶口感飽滿。除此之外，茶多酚和兒茶素總量含量較高，可從中篩選高茶多酚和高兒茶素的新品系。

24個(gè)牛皮茶新品系新梢生化成分含量變異較豐富，變異系數(shù)在3.63% ～ 27.88%，平均變異系數(shù)為11.54%，低于貴州28份茶樹種質(zhì)資源的變異系數(shù)（25.45%）和朱明珠等研究的栽培于四川省內(nèi)的60個(gè)茶樹品種間的變異系數(shù)（30.20%）[24]，且低于130個(gè)‘黃山種’自然雜交后代的變異系數(shù)（30.5%），推測(cè)是因?yàn)檫@些茶樹資源來源于不同的祖先和不同的地區(qū)，而古藺牛皮茶群體種生長(zhǎng)區(qū)域相對(duì)集中，分化程度不高。

3.2 24個(gè)牛皮茶新品系遺傳多樣性

遺傳多樣性可以用于評(píng)價(jià)物種的遺傳潛力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，24個(gè)牛皮茶新品系遺傳距離在0.0800 ～ 1.7984，距離最小的為牛皮茶20號(hào)和21號(hào)，遺傳距離最大的為牛皮茶6號(hào)和16號(hào)，多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.5259，基因多樣性指數(shù)（H）平均值為0.5753，具有較高的遺傳多樣性，育種潛力大。基于各品系間的遺傳距離，可將24個(gè)牛皮茶新品系聚為3個(gè)類群，類群Ⅰ包括牛皮茶6號(hào)和7號(hào)，牛皮茶18號(hào)單獨(dú)聚于類群Ⅱ，類群Ⅲ則包括其他21個(gè)新品系。除此之外，在SSR標(biāo)記中聚為一類的新品系生化成分存在一定差異，表明古藺牛皮茶在自然生長(zhǎng)及品種選育過程中受到環(huán)境等因素的影響，發(fā)生了一定的生理生化變異。

3.3 特異茶樹資源的篩選

參考 NY/T 2031—2011 《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評(píng)價(jià)規(guī)范 茶樹》，以氨基酸總量≥5.0%、茶氨酸≥3.0%、茶多酚總量≥25.0%或≤7.5%、兒茶素類總量≥20.0%為特異性狀初步篩選出一批潛在優(yōu)異種質(zhì)，其中牛皮茶5號(hào)、12號(hào)、17號(hào)的茶多酚含量較高，春、夏季新梢茶多酚含量都高于33%，兒茶素總量都高于23%，可作為高茶多酚及高兒茶素育種材料，且此三者春梢的EGCG含量均大于150 mg/g，夏梢的EGCG含量分別比對(duì)照高38.42%、30.16%和40.02%，可作為高EGCG茶樹的育種材料。