高羲之，張晨禹，陳建姣，易曉芹，李云飛，陳佳豪，沈程文

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

茶樹(shù) [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。據(jù)中國(guó)茶葉流通協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)18個(gè)主要產(chǎn)茶?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）茶園面積為306.52萬(wàn)hm2，干毛茶產(chǎn)量為279.34萬(wàn)t，干毛茶總產(chǎn)值達(dá)到2396億元[1]。伴隨著近十年工業(yè)化的高速發(fā)展，我國(guó)酸雨問(wèn)題日益嚴(yán)重，已成為繼歐洲和北美之后世界第三大酸雨區(qū)，中國(guó)降水年均pH值小于5.6的面積約占國(guó)土面積的40%，長(zhǎng)江中下游以南地區(qū)至少50%以上的面積降水年均pH值小于4.5，為酸雨重污染區(qū)[2]。盡管2018年酸雨發(fā)生面積相比2003年減少97萬(wàn)km2[3]，但酸雨仍是不可忽視的嚴(yán)重環(huán)境問(wèn)題。茶樹(shù)雖屬喜酸性木本植物，但強(qiáng)酸性土壤對(duì)茶樹(shù)的生長(zhǎng)和茶葉品質(zhì)仍會(huì)造成嚴(yán)重影響[4]。我國(guó)茶樹(shù)種植區(qū)大多受到酸雨的污染，探究茶樹(shù)的抗酸雨脅迫機(jī)制具有重要意義。

葉綠素是綠色植物葉綠體內(nèi)最重要的色素之一，參與光合作用，具有捕獲光能及吸收與傳遞光量子的功能。有研究表明，輕度酸雨脅迫促進(jìn)茶樹(shù)葉綠素的合成，而在重度酸雨脅迫下葉綠素含量降低，進(jìn)而影響光合作用[5]。葉綠素生物合成可分為15步反應(yīng)，主要包括兩大部分：L-谷氨酰-tRNA→原卟啉Ⅸ（proto Ⅸ）和原卟啉Ⅸ（proto Ⅸ）→葉綠素[6]。尿卟啉原脫羧酶參與第一部分的生物合成，由HEME1和HEME2基因編碼，是葉綠素生物合成的關(guān)鍵酶。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HEME2基因的研究仍十分稀缺，有待進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)。

本試驗(yàn)在模擬酸雨脅迫茶樹(shù)幼苗成熟葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在轉(zhuǎn)錄水平上初步探索了茶樹(shù)對(duì)酸雨脅迫的應(yīng)答機(jī)制，篩選出了HEME2基因，通過(guò)RTPCR技術(shù)克隆其CDS區(qū)全長(zhǎng)序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)酸雨處理葉和正常葉基因表達(dá)差異進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)抗酸性茶樹(shù)新品種篩選和培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)使用的材料為模擬酸雨脅迫處理的一年生茶樹(shù)品種湘妃翠幼苗。從湖南省長(zhǎng)沙縣高橋鎮(zhèn)茶苗繁育基地將茶樹(shù)幼苗移栽至湖南省長(zhǎng)沙市湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園實(shí)驗(yàn)基地（北緯28°18′12″，東經(jīng) 113°07′61″），置于通風(fēng)遮頂塑料大棚內(nèi)。采用裝有紅壤的塑料花盆（底直徑18 cm，口直徑 23 cm，高 25 cm）以盆栽方式進(jìn)行培養(yǎng)，培育期間澆灌自來(lái)水并補(bǔ)充定量肥料。茶苗長(zhǎng)勢(shì)正常后分為處理組和對(duì)照組，設(shè)置處理組pH=2.5，對(duì)照組pH=6.5，采用濃硫酸與濃硝酸4:1混合配制成酸雨母液，稀釋至相應(yīng)pH值，采用便攜式pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值，依據(jù)長(zhǎng)沙地區(qū)年平均降水量進(jìn)行酸雨噴淋，每4 d一次，每盆450 mL，全株噴淋。處理兩個(gè)月（2018年4月19日至6月19日），于2018年6月采摘成熟葉片作為供試材料，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉綠素含量測(cè)定

按盧翠報(bào)道的方法測(cè)定[7]。

1.3 抗氧化酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性，分別使用科銘生物的SOD活性檢測(cè)試劑盒（SOD-1-Y）、POD活性檢測(cè)試劑盒（POD-1-Y）、CAT活性檢測(cè)試劑盒（CAT-1-Y）和APX活性檢測(cè)試劑盒（APX-1-W）檢測(cè)。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

將供試材料用液氮研磨后取 0.1 ～ 0.2 g，采 用 TIANGEN 的 RNAprep Pure Plant Kit （Polysaccharides & Polyphenolics-rich） 試 劑 盒提取茶樹(shù)總RNA，RNA完整性通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度和純度使用Nano-Drop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?采用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5 CsHEME2 基因 CDS 區(qū)克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（登錄號(hào)：PRJNA 575691）得到CsHEME2基因CDS區(qū)序列，引物設(shè)計(jì)和合成由湖南擎科生物技術(shù)有限公司完成（表1）。50 μL RT-PCR擴(kuò)增體系為：I-5TM 25High-Fidelity Master Mix 25.0 μL， 上 游 引 物2.0 μL，下游引物 2.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，ddH2O 20.0 μL，總體積 50.0 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：98℃變性 10 s，56℃退火 15 s，72℃延伸 10 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后切膠回收，將回收產(chǎn)物連接至載體 pClone 007 Blunt Vector（擎科生物），轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trelief TM 5e感受態(tài)細(xì)胞（擎科生物），37℃培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色陽(yáng)性單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送至湖南擎科生物技術(shù)有限公司 測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 CsHEME2 基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線(xiàn)分析工具Protparam和Protscale[8]對(duì)CsHEME2基因進(jìn)行理化性質(zhì)和親/疏水性分析， 通 過(guò) SignalP[9]、ChloroP[10]和 TargetP[11]進(jìn)行信號(hào)肽、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，通過(guò)TMHMM和Netphos[12]進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過(guò)SOPMA[13]和Phyre2[14]模擬CsHEME2基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)BLAST工具分析CsHEME2基因與其他物種氨基酸序列同源性，并用DNAMAN與其它16種植物進(jìn)行多重氨基酸序列比對(duì)，通過(guò)MEGA 7.0采用鄰位連接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.7 CsHEME2 基因表達(dá)差異分析

根據(jù)克隆測(cè)序所得的CsHEME2基因CDS區(qū)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物qCsHEME2-F和qCsHEME2-R（表1），引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成，所使用的內(nèi)參基因?yàn)棣?actin（表 1）。使用 TaKaRa 的 TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）試劑盒檢測(cè)CsHEME2基因的表達(dá)水平。20 μL熒光定量PCR反應(yīng)體 系 為：TB GreenPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2X）10.0 μL，ROX Reference Dye II （50X）0.4 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，模板 DNA 2.0 μL，總體積 20.0 μL。配置完成后在Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀上檢測(cè)CsHEME2基因表達(dá)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán)。使用Excel 2016按照[15]算法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsHEME2基因CDS區(qū)的克隆及序列分析

通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆獲得約1200 bp的目的片段（圖1），片段大小基本上符合預(yù)期，可以確定克隆所得的目的片段為CsHEME2基因CDS區(qū)。該序列全長(zhǎng)共1182 bp，編碼393個(gè)氨基酸殘基，含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA（圖2）。

圖1 CsHEME2基因電泳圖Figure 1 Elctrophoretogram of CsHEME2

2.2 CsHEME2 基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)及親/疏水性

通過(guò)在線(xiàn)工具Protparam分析表明，CsHEME2蛋白的原子組成為C1957H3084N516O563S10，分子質(zhì)量約為43.17 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）約為 6.73 < 7，為酸性蛋白。CsHEME2蛋白共含有20種基本氨基酸殘基，其中纈氨酸Val（V）的含量最高，占10.7%；半胱氨酸Cys（C）的含量最低，占0.8%。在393個(gè)氨基酸殘基中，共含有40個(gè)負(fù)電荷氨基酸（Asp + Glu）和39個(gè)正電荷氨基酸（Arg + Lys）（圖2）。該蛋白水溶液在280 nm處的消光系數(shù)為35535，脂肪族氨基酸指數(shù)為96.90，不穩(wěn)定指數(shù)為37.28，為穩(wěn)定蛋白。在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌內(nèi)大于10 h。其親水性平均系數(shù)（GRAVY）為 0.017 > 0，屬于疏水蛋白。

圖2 CsHEME2基因CDS區(qū)核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CsHEME2 gene CDS region

根據(jù)在線(xiàn)軟件Protscale預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，位于CsHEME2蛋白肽鏈上第91位的色氨酸Ser（S）具有最低的分值-2.522，親水性最弱；位于第189位的甘氨酸Gly（G）具有最高的分值2.178，疏水性最強(qiáng)（圖3）。但從整體上看，CsHEME2蛋白肽鏈上疏水性氨基酸較親水性氨基酸多，說(shuō)明該蛋白為疏水性蛋白。

圖3 CsHEME2蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Figure 3 Hydrophilic / hydrophobic analysis of CsHEME2 protein

2.2.2 信號(hào)肽、葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

信號(hào)肽用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移，信號(hào)肽行使完功能后其自身的序列在信號(hào)肽酶的作用下被切除[16]。SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsHEME2蛋白的多肽鏈無(wú)信號(hào)肽屬于非分泌蛋白（圖4）。ChloroP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsHEME2蛋白存在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽剪切位點(diǎn)，位于第43個(gè)氨基酸，含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（圖2）。TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CsHEME2蛋白定位于葉綠體，這與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果一致，可以推測(cè)CsHEME2蛋白在游離的核糖體中合成后需要轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體上發(fā)揮作用。

圖4 CsHEME2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Figure 4 Signal peptide prediction of CsHEME2 protein

2.2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

跨膜結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞膜中蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位，一般由約20個(gè)疏水性氨基酸殘基組成形成α-螺旋，它固著在細(xì)胞膜上起“錨定”作用[17]。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，蛋白質(zhì)可分為跨膜蛋白和非跨膜蛋白。TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示，CsHEME2蛋白各氨基酸位點(diǎn)處于膜外的概率極接近1，可信度較高，這表明CsHEME2蛋白整條多肽鏈位于細(xì)胞膜外，不存在跨膜區(qū)，說(shuō)明該蛋白屬于非跨膜蛋白。磷酸化是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類(lèi)型，它在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性、結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮著重要作用。Netphos預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，該蛋白含有36個(gè)可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)，其中包括24個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)、9個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)以及3個(gè)酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)。

圖5 CsHEME2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Figure 5 Transmembrane domain prediction of CsHEME2 protein

圖6 CsHEME2蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Figure 6 Phosphorylation sites prediction of CsHEME2 protein

2.2.4 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白功能域預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的氨基酸殘基借助氫鍵折疊和盤(pán)繞形成的結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲等[18]。SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白包含4種二級(jí)結(jié)構(gòu)形式，其中α-螺旋占39.19%，是CsHEME2蛋白最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)；其次無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占35.62%、18.32%和6.87%，不存在β-折疊（圖7-A）。Phyre2預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7-B所示，CsHEME2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)多由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果相符，并且HEME2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型與其模板d1j93a的相似性高達(dá)90%，說(shuō)明所預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)較可靠。

圖7 CsHEME2蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Figure 7 Secondary structure and tertiary structure prediction of CsHEME2 protein

使用NCBI網(wǎng)站中的在線(xiàn)工具CD-Search預(yù)測(cè)CsHEME2蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖8所示。CsHEME2含有PLN02433保守結(jié)構(gòu)域（圖2），屬于URO-D_CIMS_like超家族；PLN02433含有6個(gè)活性位點(diǎn)（Active site），分別位于CsHEME2蛋白多肽鏈上第73位（R）、第77位（R）、第123位（D）、第200位（Y）、第255位（S）和第370位（H）氨基酸，另外還含有26個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)（Substrate binding site）。

圖8 CsHEME2蛋白質(zhì)功能域預(yù)測(cè)Figure 8 Functional domains prediction of CsHEME2

2.2.5 多重氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI網(wǎng)站的Blastp在線(xiàn)分析茶樹(shù)CsHEME2基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其它物種的氨基酸同源性，結(jié)果顯示，中華獼猴桃、葡萄和核桃等7種植物與CsHEME2基因氨基酸序列同源性達(dá)到了90%以上，CsHEME2基因氨基酸序列與模式植物擬南芥AtHEME2基因的氨基酸同源性達(dá)到79%、與‘舒茶早’茶樹(shù)CsHEME2基因的氨基酸同源性達(dá)到98%。通過(guò)DNAMAN對(duì)CsHEME2基因氨基酸序列和16個(gè)與其氨基酸同源性較高的物種進(jìn)行多重氨基酸序列比對(duì)（圖9），可以發(fā)現(xiàn)，這16個(gè)物種均含有PLN02433保守結(jié)構(gòu)域以及該結(jié)構(gòu)域所含的活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)。使用MEGA7.0軟件采用內(nèi)置的鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖10），結(jié)果表明整體聚為兩大類(lèi)，各類(lèi)再分為多個(gè)小類(lèi)；其中茶樹(shù)和中華獼猴桃聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系最近，這可能與茶樹(shù)和中華獼猴桃同源性較高有關(guān)；木薯和橡膠樹(shù)聚為一類(lèi)，屬于大戟科植物；胡楊和毛果楊聚為一類(lèi)，屬于楊柳科植物；西葫蘆、黃瓜和甜瓜聚為一類(lèi)，屬于葫蘆科植物。不同科之間的物種也有較近的親緣關(guān)系，如胡桃科的核桃和木棉科的榴蓮，以及茜草科的小果咖啡和茄科的番茄等。

圖9 HEME2多序列比對(duì)Figure 9 Multiple sequence alignment of HEME2

圖10 不同植物間HEME2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 10 Polygenetic tree of HEME2 from different plants

2.3 CsHEME2 基因表達(dá)差異分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了本試驗(yàn)克隆的CsHEME2基因在模擬酸雨脅迫處理葉片和正常葉片中的表達(dá)水平（圖11），結(jié)果顯示該基因在模擬酸雨脅迫處理葉片中的相對(duì)表達(dá)量比在正常葉片中高并存在極顯著差異，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符[19]。葉綠素含量測(cè)定的結(jié)果顯示（表2），酸雨葉片中的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a/b含量均比正常葉片低，且存在極顯著差異，結(jié)合qRT-PCR結(jié)果可推測(cè)CsHEME2基因?qū)θ~綠素的生物合成是負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

圖11 CsHEME2在不同葉片中的表達(dá)差異分析Figure 11 Analysis of differential expression of CsHEME2 in different leaves

表2 模擬酸雨對(duì)茶樹(shù)幼苗葉片葉綠素含量的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 2 Effects of simulated acid rain on chlorophyll content in leaves of tea seedlings (mean value ± standard deviation)

2.4 抗氧化酶活性分析

SOD、POD、CAT、APX均是植物細(xì)胞內(nèi)具有的重要抗氧化酶，在植物抗逆生理中起著關(guān)鍵作用，當(dāng)植物處于逆境時(shí)，抗氧化酶對(duì)維持植物正常生長(zhǎng)有著十分密切的關(guān)系。如圖12所示，四種抗氧化酶活性在pH值2.5的酸雨脅迫下都顯著提高，表明酸雨脅迫觸發(fā)了茶樹(shù)的防御機(jī)制以抵抗脅迫。

圖12 模擬酸雨對(duì)茶樹(shù)幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Figure 12 Effects of simulated acid rain on antioxidant enzyme activities in leaves of tea seedling

3 討論

HEME2基因廣泛存在于植物、真菌及細(xì)菌中，是四吡咯代謝的關(guān)鍵酶基因，與葉綠素合成及血紅素的合成有關(guān)。但是，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)HEME2基因的研究較少。本試驗(yàn)以茶樹(shù)為材料，克隆了CsHEME2基因，并分別進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析。

試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了CsHEME2基因CDS區(qū)，序列全長(zhǎng)共1182 bp，編碼393個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸具有植物HEME2的PLN02433保守結(jié)構(gòu)域，并含有此結(jié)構(gòu)域特有的活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)；多序列比對(duì)顯示CsHEME2與中華獼猴桃、葡萄和核桃等7種植物HEME2氨基酸序列同源性達(dá)到了90%以上，與“舒茶早”茶樹(shù)品種的CsHEME2基因的氨基酸同源性達(dá)到98%，試驗(yàn)所克隆的基因?qū)儆谥参颒EME家族成員。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，茶樹(shù)和中華獼猴桃聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系最近，這可能與茶樹(shù)和中華獼猴桃同源性較高以及同屬于山茶目植物有關(guān)，表明HEME2在近似物種中具有較高的保守性，這與王希希[20]和閆菲[21]等的研究結(jié)果相似。對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，CsHEME2蛋白屬于酸性疏水蛋白，含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，主要在葉綠體中發(fā)揮作用，表明四吡咯代謝的部分反應(yīng)可能在葉綠體中進(jìn)行。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在卟啉和葉綠素代謝通路中只有編碼尿卟啉原脫羧酶的HEME1和HEME2基因出現(xiàn)差異表達(dá)并且表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證顯示HEME2在酸雨葉片的相對(duì)表達(dá)量比在正常葉片中高，結(jié)合葉綠素含量測(cè)定結(jié)果可推測(cè)HEME2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受酸雨脅迫誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)并負(fù)反饋調(diào)節(jié)葉綠素的生物合成，使葉綠素含量下降；同時(shí)也有研究表明，質(zhì)體中增加的四吡咯代謝中間產(chǎn)物可以觸發(fā)整個(gè)細(xì)胞的抗氧化反應(yīng)[22]，尿卟啉原脫羧酶在葉綠素合成通路中催化尿卟啉原Ⅲ轉(zhuǎn)化為糞卟啉原Ⅲ，酸雨脅迫下尿卟啉原脫羧酶受到抑制，導(dǎo)致四吡咯中間體尿卟啉原III（Uroporphyrinogen III）的過(guò)度積累，尿卟啉原III作為一種強(qiáng)光敏劑很容易被光激發(fā)，如果不及時(shí)淬滅，可能會(huì)導(dǎo)致形成劇毒的自由基和單線(xiàn)態(tài)氧[23]，使細(xì)胞遭受損傷，但同時(shí)四吡咯中間體的積累觸發(fā)了細(xì)胞保護(hù)和防御機(jī)制[22]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，四種抗氧化酶活性在模擬酸雨脅迫下都顯著提高，推測(cè)尿卟啉原III的積累使茶樹(shù)對(duì)模擬酸雨脅迫產(chǎn)生了氧化應(yīng)激以抵抗脅迫。綜上，可以推測(cè)HEME2基因在響應(yīng)酸雨脅迫中發(fā)揮一定的作用。

本試驗(yàn)采用RT-PCR方法對(duì)茶樹(shù)HEME2基因CDS區(qū)進(jìn)行克隆，初步探索了茶樹(shù)中HEME2基因的表達(dá)和對(duì)酸雨脅迫的響應(yīng)并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究該基因在茶樹(shù)酸雨脅迫中的功能奠定基礎(chǔ)。有關(guān)HEME家族基因的深入分析和功能鑒定，還有待進(jìn)一步深入研究，可通過(guò)亞細(xì)胞定位、基因沉默技術(shù)和轉(zhuǎn)基因等方法實(shí)現(xiàn)。