劉建珍，陳鴻楨，林鏗

（廣州市花都區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510800）

0 引言

無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)(non-invasive prenatal testing,NIPT)即孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷,是應(yīng)用高通量基因測(cè)序等分子遺傳技術(shù)檢測(cè)孕期母體外周血中胎兒游離DNA片段，以評(píng)估胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體異常風(fēng)險(xiǎn)[1]。NIPT具有無(wú)創(chuàng)性、安全、高準(zhǔn)確性、高特異性等優(yōu)勢(shì)，在臨床上受到越來(lái)越高的重視[2]。本文通過(guò)對(duì)7656例孕婦NIPT檢測(cè)結(jié)果的回顧性分析、對(duì)比產(chǎn)前診斷結(jié)果及隨訪妊娠結(jié)局，從而評(píng)估NIPT在胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇 2017年1月至2019年12月于本中心做NIPT篩查的孕婦7656例，孕婦年齡集中在18～45歲之間，符合NIPT檢測(cè)指征，充分告知孕婦NIPT檢測(cè)范圍、技術(shù)優(yōu)勢(shì)、局限性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。孕婦自愿選擇接受 NIPT，采血前均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 NIPT檢測(cè)

于孕12周～34+6周采集孕婦外周血10 mL，提取游離DNA，高通量測(cè)序檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析主要由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。步驟嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行：(1)外周血DNA的提??；(2)文庫(kù)構(gòu)建；(3)上機(jī)測(cè)序；(4)數(shù)據(jù)處理與分析完成報(bào)告的生成。LIFE的Ion Proton平臺(tái),采用DA 8600 基因測(cè)序儀,應(yīng)用半導(dǎo)體測(cè)序法進(jìn)行高通量基因測(cè)序及數(shù)據(jù)分析,預(yù)測(cè)胎兒患染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)比率。NIPT的結(jié)果采用Z值風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(正常范圍為-3～3分)表示,Z值≥3分或Z值≤-3分時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)為高風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 羊水細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析

對(duì)NIPT提示胎兒染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)者,經(jīng)遺傳咨詢(xún)及知情同意后,超聲引導(dǎo)定位,無(wú)菌操作,經(jīng)腹羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL,采用胰蛋白酶消化方法,常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng)、觀察、收獲、制片、G顯帶,人工分析20個(gè)染色體核型,按照人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體系(ISCN 2016)進(jìn)行染色體核型描述及診斷。

1.2.3 妊娠結(jié)局隨訪

對(duì)所有孕婦的妊娠結(jié)局進(jìn)行追蹤隨訪, 隨訪內(nèi)容包括胎兒妊娠結(jié)局、出生缺陷情況等。

2 結(jié)果

2.1 NIPT篩查情況

行NIPT的孕婦7656例，染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)66例，檢出率為0.86%，其中21三體20例(0.26%)，18-三體綜合征9例(0.12%)，13-三體綜合征5例(0.06%)，性染色體異常21例(0.27%)，其他常染色體異常11例(0.14%)，見(jiàn)表1。

2.2 NIPT與羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果符合情況

66例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，59例孕婦行羊水穿刺做細(xì)胞染色體核型分析，確診真陽(yáng)性39例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為66.1%，其 中21三 體 高 風(fēng) 險(xiǎn)94.74%(18/19)，18三 體 高風(fēng)險(xiǎn)55.56%(5/9),13三體高風(fēng)險(xiǎn)0(0/5),性染色體高風(fēng)險(xiǎn)61.11%(11/17),其他常染色體高風(fēng)險(xiǎn)55.56%(5/9)。假陽(yáng)性20例，包括1例21三體高風(fēng)險(xiǎn)，4例18三體高風(fēng)險(xiǎn)，5例13三體高風(fēng)險(xiǎn)，6例性染色體高風(fēng)險(xiǎn)，4例其他常染色體高風(fēng)險(xiǎn)，NIPT的靈敏度是97.5%,特異度是99.74%,見(jiàn)表2。

表1 NIPT篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦檢出情況

表2 59例NIPT篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦胎兒侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果

2.3 隨訪情況

59例行羊水穿刺做染色體核型分析中，真陽(yáng)性39例，全部選擇終止妊娠；20例NIPT假陽(yáng)性者，1例因B超提示多發(fā)畸形而終止妊娠，其余均選擇了繼續(xù)妊娠。7例孕婦拒絕進(jìn)一步介入性產(chǎn)前診斷，1例NIPT性染色體高風(fēng)險(xiǎn)者直接引產(chǎn)；3例NIPT性染色體高風(fēng)險(xiǎn)者和1例NIPT提示其他常染色體異常孕婦繼續(xù)妊娠，新生兒出生后未行染色體核型分析，家屬自述未見(jiàn)明顯異常；1例NIPT 提示21三體高風(fēng)險(xiǎn)和1例其他常染色體異常者拒絕隨訪，見(jiàn)表3。

表3 66例NIPT異常孕婦產(chǎn)前診斷及隨訪結(jié)果

3 討論

染色體病構(gòu)成人類(lèi)遺傳性疾病的一大類(lèi)。通過(guò)對(duì)流產(chǎn)、死產(chǎn)、新生兒和一般人群的調(diào)查表明，染色體異常占流產(chǎn)胚胎的50～70%，占死產(chǎn)嬰的10%，占新生兒死亡者的10%，占新生兒的5‰～10‰，占一般人群的5‰[3],主要包括21三體綜合征、18三體綜合征和13三體綜合征 。對(duì)該類(lèi)疾病的篩查傳統(tǒng)上是通過(guò)母體血清學(xué)標(biāo)志物和胎兒超聲篩查來(lái)評(píng)估，確診是通過(guò)介入性產(chǎn)前診斷。孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查(NIPT)是基于對(duì)于孕期母親外周血游離DNA平行測(cè)序，是常見(jiàn)胎兒染色體非整倍體異常的一種產(chǎn)前篩查技術(shù)。我國(guó)于2016年發(fā)布了NIPT臨床應(yīng)用規(guī)范[4]，使其在臨床應(yīng)該更廣泛和有序。

NIPT在常見(jiàn)胎兒染色體非整倍體檢測(cè)中具有極高的靈敏度和特異性，本研究中，其靈敏度和特異性分別為97.5%和99.74%，與鄭蕓蕓等[5]報(bào)道的相符，其中21三體、18三體敏感度達(dá)100%，特異度達(dá)99.9%。染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)66例，陽(yáng)性率為0.86%，NIPT低風(fēng)險(xiǎn)隨訪確診7590例，檢出率為99.14%。相比文獻(xiàn)報(bào)道，孕中期的三聯(lián)篩查方案71%的檢出率5%的假陽(yáng)性率[6]，NIPT檢出率更高，陽(yáng)性率低，大大降低了因傳統(tǒng)血清學(xué)篩查陽(yáng)性而做介入性產(chǎn)前診斷，減輕了臨床產(chǎn)前診斷的工作量，也減少了因篩查陽(yáng)性結(jié)果給孕婦帶來(lái)的焦慮。有研究顯示，自2012年以來(lái)，由于NIPT應(yīng)用降低了40%～76%的介入性診斷[7]。

NIPT在不同的疾病中診斷效率不同，本研究66例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)中,用羊水細(xì)胞染色體核型分析驗(yàn)證了其中的59例，真陽(yáng)性39例(66.1%)。以21三體綜合征準(zhǔn)確度最高，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.74%，明顯高于其他檢測(cè)項(xiàng)目，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的92.16%～100%統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致[5,8-10],表明21三體綜合征在NIPT檢測(cè)結(jié)果的可靠性非常高。18三體綜合征在NIPT中結(jié)果可靠性比21三體綜合征低，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為55.56%，與相關(guān)報(bào)道的50%～91.67%[5,8-10]相符。本研究中13三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn)5例，經(jīng)產(chǎn)前診斷確診后，均為假陽(yáng)性，假陽(yáng)性100%，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值9.4%～50%[5,8-9]不符，分析其原因，可能是減數(shù)分裂形成13三體綜合征異常受精卵過(guò)程中容易形成胎兒自救機(jī)制，導(dǎo)致限制性胎盤(pán)嵌合體(CPM)，即胎兒核型正常，胎盤(pán)出現(xiàn)正常和異常的染色體嵌合體[11]；也可能是由于13號(hào)染色體的鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷酸和胞嘧啶脫氧核糖核苷酸含量較低，導(dǎo)致測(cè)序時(shí)產(chǎn)生偏差；或由于13 三體孕婦的胎盤(pán)較小，釋放入母血的游離胎兒DNA數(shù)量相對(duì)較少造成[12]；也可能與本研究的樣本量較少等有關(guān)，后續(xù)需要更大樣本統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)估13三體綜合征在NIPT應(yīng)用的價(jià)值。

性染色體非整倍體產(chǎn)前檢測(cè)在NIPT技術(shù)應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)有的研究報(bào)道差別較大。本研究性染色體異常陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為61.11%，比燕鳳、陶荷花和鄭蕓蕓等人報(bào)道的33.33%-59.26%[8-10]高，這可能與納人人群和標(biāo)本量有關(guān)。分析影響性染色體非整倍體在NIPT檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，可能是X和Y染色體上存在基因高度同源性[13]，或是胎兒分?jǐn)?shù)、胎盤(pán)嵌合、母體嵌合以及母體x染色體拷貝數(shù)變異等[14]。

對(duì)于NIPT檢測(cè)中意外發(fā)現(xiàn)的其他常染色體異常，國(guó)內(nèi)外對(duì)此相關(guān)報(bào)道較少，本研究11例高風(fēng)險(xiǎn)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為55.56%。9例通過(guò)羊水穿刺染色體核型分析顯示，6例有明顯的結(jié)構(gòu)異常，3例染色體核型分析未見(jiàn)異常，可能是NIPT假陽(yáng)性，或是其微缺失、微重復(fù)等細(xì)小的結(jié)構(gòu)變化，低于細(xì)胞染色體核型分析的檢測(cè)水平，對(duì)該類(lèi)型患者，建議做CMA等更一步的檢測(cè)的，減少誤診漏診等。

本研究中10.6%（7/66）高風(fēng)險(xiǎn)樣本拒絕做介入性產(chǎn)前診斷，1例直接進(jìn)行引產(chǎn)，存在非必要引產(chǎn)的可能。2例孕婦家屬不愿透露妊娠結(jié)局導(dǎo)致失訪，4例繼續(xù)妊娠，經(jīng)對(duì)新生兒隨訪，家屬自述暫未見(jiàn)異常，需繼續(xù)做更長(zhǎng)期的隨訪追蹤。因此，臨床上需要進(jìn)一步加強(qiáng)產(chǎn)前診斷的遺傳咨詢(xún)和認(rèn)知科普工作，充分掌握 NIPT 的適應(yīng)證，多種產(chǎn)前篩查方法聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議做進(jìn)一步產(chǎn)前診斷，提高提高染色體異常檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

綜上所述，NIPT在胎兒染色體非整倍體疾病篩查存在敏感度好、特異性好和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)21三體綜合征檢測(cè)準(zhǔn)確度極高，18三體和性染色體異常的準(zhǔn)確度還有待提高，而13三體假陽(yáng)性極高，需后續(xù)更大的數(shù)據(jù)分析其在NIPT的篩查效率，對(duì)于其他常染色體異常在NIPT的應(yīng)用還有很多爭(zhēng)議，需更多是數(shù)據(jù)分析支持其在NIPT的應(yīng)用價(jià)值。NIPT畢竟是一種篩查技術(shù)，存在假陰性及假陽(yáng)性，對(duì)于其提示的高風(fēng)險(xiǎn)仍需通過(guò)介入性產(chǎn)前診斷來(lái)確診。該技術(shù)亦和其他所有檢測(cè)技術(shù)一樣，存在自身的局限性，如無(wú)法篩查染色體結(jié)構(gòu)異常、染色體平衡結(jié)構(gòu)異常，對(duì)低比例的嵌合體染色體容易漏診,對(duì)多胎妊娠、體型肥胖孕婦等特殊人群無(wú)法使用,因此，應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)產(chǎn)前診斷的遺傳咨詢(xún)和認(rèn)知科普工作，臨床應(yīng)充分掌握NIPT的適應(yīng)證，告知孕婦該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和局限性，多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，提高染色體異常檢測(cè)的準(zhǔn)確性，防止誤檢漏檢，做好優(yōu)生優(yōu)育。