黃正迎，毛惠，李品英

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

0 引言

2017年我國衛(wèi)生和計劃生育統(tǒng)計年鑒的數(shù)據(jù)表明，2016年中國的人工流產(chǎn)人數(shù)達964萬[1]。而人工流產(chǎn)中無論是負壓吸引術(shù)還是藥物流產(chǎn)，均會損傷子宮內(nèi)膜，破壞女性本身的防護屏障，對女性生殖系統(tǒng)及其功能造成潛在危害[2]。近年來運用米非司酮和米索前列醇終止早孕的方法在全世界范圍內(nèi)廣泛使用；藥物流產(chǎn)作為簡便、有效的非手術(shù)終止妊娠的方法，被大多數(shù)婦女所接受，它還具備病人樂意接受、減少住院次數(shù)等優(yōu)點[3]。藥物流產(chǎn)與負壓吸引術(shù)相比，避免了漏吸、空吸、子宮穿孔、人工流產(chǎn)綜合征等并發(fā)癥，但也會出現(xiàn)不全流產(chǎn)、絨毛蛻膜殘留、子宮異常出血等常見并發(fā)癥，使其在臨床應用過程中受到一定的限制，研究縮短和減少藥物流產(chǎn)后子宮異常出血的治療方法顯得尤為重要。我院院內(nèi)制劑益母縮宮顆粒廣泛用于藥物流產(chǎn)、順產(chǎn)后，前期臨床研究表明其可通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌激素、改善凝血功能來幫助子宮內(nèi)膜修復、促進子宮復舊從而減少藥物流產(chǎn)后子宮異常出血[4-6]，但其作用機制仍不十分明確。本次研究通過建立米非司酮+米索前列醇建立藥物不全流產(chǎn)大鼠模型，經(jīng)益母縮宮顆粒干預后，測定大鼠血漿中FN、LN、ColIV的值，從而探討益母縮宮顆粒參與藥物流產(chǎn)后子宮內(nèi)膜修復、減少子宮異常出血的作用機制與細胞外基質(zhì)的關(guān)系。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級性成熟SD大鼠，雄性大鼠25只，雌性大鼠60只，均由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供；雌性大鼠體重220～260g，雄性大鼠體重250～280g，許可證號 SCXK（川）2018-17。購買后分籠適應性喂養(yǎng)1周，大鼠全天自由飲水，繁殖飼料喂養(yǎng)；培育室溫度21℃-22℃，濕度60%-80%，人工光照（12h晝，12h夜）；均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號SYXK（川）2018-065）。

1.2 實驗藥物

益母縮宮顆粒，10g/袋，批號：20191119,西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院。

米非司酮，25 mg/片，批號：432005041，華潤紫竹藥業(yè)有限公司。

米索前列醇，0.2 mg/片，批號：43200304，華潤紫竹藥業(yè)有限公司。

縮宮素，1mL/支，1mL：10單位，批號21908013，南京新百藥業(yè)有限公司。

注射用苯巴比妥鈉，0.1g/瓶，批號190503，上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，使用時用生理鹽水配制成10%溶液，按50mg/Kg腹腔注射麻醉。

所有灌胃藥物均根據(jù)人鼠劑量比換算成大鼠灌胃劑量，成人體重按60 kg計算。

1.3 主要試劑及儀器

試劑：Rat FN ELISA KIT，貨號：ZC-37348，規(guī)格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn)；Rat LN ELISA KIT，貨號：ZC-36446，規(guī)格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn)；Rat Col IV ELISA KIT，貨號：ZC-36018，規(guī)格：96孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產(chǎn)。

儀器與耗材：計算機，型號 TFT185W80PS，冠捷顯示科技有限公司生產(chǎn)；酶標儀，型號pectraMAX Plus384，美谷分子儀器有限公司生產(chǎn)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，型號 UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司生產(chǎn)；高速微量離心機，型號：5424GI174620，德國艾本德股份有限公司；電子恒溫水浴鍋，型號DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產(chǎn)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，型號SYQ-DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；移液槍，規(guī)格，1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司生產(chǎn)；槍頭，規(guī)格，1000μL、200μL、20μL，美國Axygen公司生產(chǎn)； EP管，規(guī)格：1.5mL、0.2mL、100μL，美國Axygen公司生產(chǎn)。

2 實驗方法及步驟

2.1 實驗動物造模、分組及給藥

參照王曉東[7]造模法制備藥物不全流產(chǎn)大鼠模型，選擇SPF級成熟雌性大鼠60只，成熟雄性大鼠25只，適應性喂養(yǎng)7天后，隨機挑選10只未合籠雌性大鼠作為空白組。其余大鼠按照雌雄2：1比例于下午18時合籠，次日晨8時檢查陰道涂片，發(fā)現(xiàn)有精子者為妊娠第1天。若雌鼠未受孕，則繼續(xù)于下午18時與雄鼠按2:1合籠，連續(xù)合籠3-5天，然后換批次繼續(xù)合籠。最終受孕大鼠，均于妊娠第7天早上8時灌服米非司酮（8.3mg/kg），下午18時灌服米索前列醇（100ug/kg），并在雌性大鼠陰道內(nèi)置入一個清潔棉球，次日檢查大鼠陰道內(nèi)棉球，查見血跡則基本認為造模成功。

將最終造模成功的48只大鼠隨機分為5組，分別為：模型組、縮宮素對照組（縮宮素組）、益母縮宮顆粒低劑量組（低劑量組）、益母縮宮顆粒中劑量組（中劑量組）、益母縮宮顆粒高劑量組（高劑量組），其中高劑量組和中劑量組每組9只，其余各組每組10只。上訴各組大鼠分別于妊娠第8天開始做如下處理：模型組：灌胃動物飲用水（NS）連續(xù)7天（每只灌胃飲用水1mL/（100g.d））；縮宮素對照組：連續(xù)3天肌注縮宮素0.9U/（kg.d）。益母縮宮顆粒各組：灌胃益母縮宮顆粒，低劑量組1.562g/（kg.d），中劑量組3.125g/（kg.d）、高劑量組6.25g/（kg.d）連續(xù)7天。而空白組大鼠則于妊娠第7天開始，灌胃實驗中心實驗動物飲用水1mL/（100g.d），連續(xù)8天。大鼠按1mL/100g計算灌胃量。

2.2 動物標本的采集

各組大鼠于妊娠第15天時，予以10%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉。解剖大鼠，找到腹主動脈，抽取血液約5mL，靜置半小時，采集上層血清離心機離心（3200r，12min），以無菌吸管吸取上層血清約2mL，凍存于-80℃冰箱，以待后續(xù)檢驗。

2.3 指標檢測方法與步驟

2.3.1 指標檢測方法

本實驗將FN、LN、ColIV抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或者樣本，其中的FN、LN、ColIV連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入辣根過氧化物酶標記的抗體，將未結(jié)合的抗體洗凈后再次加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FN、LN、ColIV呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

2.3.2 具體步驟

①復溫：將所有試劑逐漸平衡至室溫。②加樣：空白孔，空白對照孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調(diào)零；標準品孔，加入配好的標準品50μL，然后加入辣根過氧化物酶100μL；待測樣品孔，加入樣本50μL，然后辣根過氧化物酶100μL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60min。③配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。④洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置1min后棄去，如此重復5次，拍干。⑤顯色：每孔先加入底物液A50μL，再加入底物液B50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。⑥終止：每孔加終止液50μL，終止反應。在15min內(nèi)，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

2.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)資料用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有資料均為數(shù)值變量且符合正態(tài)性及方差齊，使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，組間比較用LSD-t法進行分析，所有數(shù)值以均數(shù)±標準差（±s）表示。P＜0.05則認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 妊娠第15天時，各組大鼠血漿FN、LN的水平變化

表1 各組大鼠血清中FN、LN濃度的變化（±SD）

與模型組相比，空白組、縮宮素組大鼠血漿FN、LN水平明顯降低，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；中劑量組、高劑量組血漿FN、LN降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；而低劑量組與模型組相比，有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

與空白組相比，模型組、低劑量組血漿FN、LN水平升高，統(tǒng)計學差異明顯（P＜0.01）；縮宮素組、中劑量組、高劑量組血漿FN、LN水平有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 妊娠第15天時，各組大鼠血漿ColIV的水平變化

表2 各組大鼠血漿中Col IV濃度的變化（±SD）

與模型組相比，空白組、縮宮素組、中劑量組、高劑量組大鼠血漿Col IV水平降低，有明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；而低劑量組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

與空白組相比，模型組、低劑量組血漿Col IV水平上升，差異明顯（P＜0.01），而縮宮素組、中劑量組、高劑量組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

4 討論

纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、層粘連蛋白(laminin,LN)、膠原纖維、糖蛋白等是組成細胞外基質(zhì)（extraceliular mat riX，ECM）的主要成分。生理狀態(tài)下，ECM 處于不斷生成和降解的動態(tài)平衡中,影響著細胞的增殖、分化、粘附、形態(tài)發(fā)生等過程；若ECM過度生成則會導致組織器官的纖維化[8-9]。子宮內(nèi)膜周期性的脫落伴隨出血、止血和修復、增殖、分化等過程也涉及到ECM的水解[10]。

FN主要分為血漿纖維連接蛋白和細胞纖維連接蛋白，是一種非膠原糖蛋白。血漿纖維連接蛋白具有促進組織修復、增加細胞間連接、調(diào)節(jié)細胞分裂和增殖等作用；細胞纖維連接蛋白在細胞之間起連接作用，影響細胞的遷移與分化[11]。FN在子宮組織中主要分布于絨毛上皮基膜、絨毛間質(zhì)、蛻膜間質(zhì)及滋養(yǎng)細胞中，它在月經(jīng)周期中主要參與子宮內(nèi)膜的脫落和修復、內(nèi)膜脫膜化及胚胎著床等各個方面，且具有重大意義[12-13]。

層粘連蛋白(laminin,LN)存在于基底膜中，也是一種特有的非膠原糖蛋白；它與Ⅳ型膠原一起構(gòu)成基膜, 能共同連接和維持組織的形態(tài)。LN是胚胎發(fā)育中最早出現(xiàn)的ECM成分，它和FN在子宮內(nèi)膜上的分布相似，是蛻膜細胞生長發(fā)育所需微環(huán)境的重要物質(zhì)，在細胞生長、分化、增殖及細胞黏附中起關(guān)鍵作用[14-15]。而IV型膠原呈薄網(wǎng)狀分布于多種組織基底膜中，屬于基膜膠原；它可使組織結(jié)構(gòu)更完整，為其他生物大分子的組裝提供框架[16-17]。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮及米索前列醇可以使蛻膜組織中FN、LN的水平較正常妊娠時明顯下降，使胚胎與子宮內(nèi)膜的聯(lián)系中斷，從而抑制胚胎的早期發(fā)育；而ColIV的下降使得其對胚胎的支持連接作用也消失，使胚胎從子宮內(nèi)膜上脫落，排出體外[18]。

藥物不全流產(chǎn)是指口服米非司酮及米索前列醇后，宮內(nèi)妊娠組織排出不全，蛻膜組織及絨毛組織殘留宮腔的一種并發(fā)癥，其危害主要是長期異常子宮出血、繼發(fā)感染、月經(jīng)紊亂等。本研究結(jié)果顯示，中劑量組、高劑量組及縮宮素組均可降低藥物不全流產(chǎn)大鼠血漿中FN、LN的水平，其中縮宮素下降效果明顯；縮宮素組、中劑量組及高劑量組均可降低大鼠血漿中Col IV的水平，且三組差異均較明顯。藥物不全流產(chǎn)后高水平的FN、LN、ColIV使得蛻膜絨毛組織與子宮內(nèi)膜緊密黏附，而殘留的蛻膜絨毛組織使得子宮收縮乏力，持續(xù)異常出血；而縮宮素、益母縮宮顆粒通過降低血漿中FN、LN、ColIV的水平，減少蛻膜絨毛組織與子宮內(nèi)膜的黏附，從而使蛻膜絨毛組織排出體外，減少子宮異常出血。

綜上所述，益母縮宮顆粒減少藥物不全流產(chǎn)后子宮異常出血的機制，可能是通過降低藥物不全流產(chǎn)大鼠血漿FN、LN及ColIV的表達，促進殘留絨毛、蛻膜組織的排出，從而加速受損子宮內(nèi)膜基質(zhì)的修復。但益母縮宮顆粒的此種作用具體通過什么途徑調(diào)節(jié)，仍待下一步研究討論。