曾維英 賴振光 孫祖東 楊守臻 陳懷珠 唐向民

基于BSA-Seq和RNA-Seq方法鑒定大豆抗豆卷葉螟候選基因

曾維英**賴振光**孫祖東*楊守臻 陳懷珠 唐向民

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南玉米大豆間套作區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站, 廣西南寧 530007

豆卷葉螟(Fabricius)是重要的大豆食葉性害蟲, 挖掘大豆抗豆卷葉螟相關(guān)基因?qū)Υ蠖箍瓜x品種選育和遺傳改良至關(guān)重要。本研究用大豆高抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2和高感豆卷葉螟材料皖82-178進(jìn)行雜交構(gòu)建F2代分離群體, 從303個(gè)F2代單株中挑選出高抗豆卷葉螟和高感豆卷葉螟的單株各30株, 分別構(gòu)建2個(gè)極端性狀的DNA混合池用于全基因組重測(cè)序以分析控制豆卷葉螟相關(guān)的候選基因。結(jié)果表明, 4個(gè)樣本中共有11,963,077個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)標(biāo)記, 根據(jù)SNP-index方法關(guān)聯(lián)分析, 共有329個(gè)基因位于99%置信區(qū)間外, 這些基因主要集中在7號(hào)染色體5,601,065～5,865,237 bp區(qū)間(總長為0.26 Mb)、16號(hào)染色體2,975,110～6,336,096 bp區(qū)間(總長為3.36 Mb)、18號(hào)染色體44,366,115～54,297,600 bp區(qū)間(總長為9.93 Mb)等區(qū)域內(nèi)。將BSA-Seq結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn), 有12個(gè)基因相關(guān)聯(lián); 最后, 結(jié)合生物信息學(xué)分析、候選基因的表達(dá)模式和基因的同源注釋, 鎖定、轉(zhuǎn)錄因子、、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、等12個(gè)基因?yàn)榭刂贫咕砣~螟性狀相關(guān)的候選基因。本研究結(jié)果不僅為解析大豆抗豆卷葉螟的分子機(jī)理奠定重要的基礎(chǔ), 也將為大豆抗蟲基因的克隆奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

大豆; 豆卷葉螟; BSA-Seq; RNA-Seq; 候選基因

大豆是我國植物蛋白和食用油的主要來源, 蟲害是影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。豆卷葉螟(Fabricius)分布于東北、黃淮海及南方地區(qū)[1], 是南方和黃淮大豆產(chǎn)區(qū)主要食葉性害蟲[2-3], 一年可發(fā)生4～5代, 有世代重疊現(xiàn)象, 在溫度、濕度適宜時(shí)會(huì)大面積發(fā)生, 一般造成大豆減產(chǎn)15%～20%, 嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%以上。為害嚴(yán)重的年份, 葉片被取食后只剩葉脈和葉柄, 造成產(chǎn)量的嚴(yán)重?fù)p失[3-5]。

鑒于豆卷葉螟為害的嚴(yán)重性, 國內(nèi)外在大豆抗豆卷葉螟方向展開了深入研究, 已鑒定出高抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2、豐平黑豆等, 也鑒定出了高感材料皖82-178、山東大豆等[6-7]; 控制豆卷葉螟的抗性位點(diǎn)主要位于A2、C2、D1a、D1b、H、K和O等連鎖群上[8-10]; 可溶性糖含量、茉莉酸含量、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性只與豆卷葉螟誘導(dǎo)有關(guān), 而超氧化物岐化酶活性、乙烯和脫落酸含量與蟲害誘導(dǎo)和材料基因型都有關(guān)[11]; 大豆胰蛋白酶抑制劑、查爾酮異構(gòu)酶4、脂氧合酶9等可能是大豆抗豆卷葉螟潛在的靶標(biāo)蛋白(基因)[12-14], gma-miR156q、gma-miR166u、gma-miR166b、gma-miR319d、gma-miR394a-3p和gma-miR396e等miRNA可能參與大豆抗豆卷葉螟的抗性調(diào)控[15]。

目前, 大豆抗蟲基因主要源于微生物的蘇云金芽孢桿菌(, Bt)殺蟲晶體蛋白基因(), 并轉(zhuǎn)入大豆中獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆。郭東全等[16]將構(gòu)建的和高效雙價(jià)殺蟲基因轉(zhuǎn)入到吉林20與吉林27大豆品種中, 獲得了高效抗蟲且基本穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆; 陳秀華等[17]將基因轉(zhuǎn)化到綏農(nóng)14中, 得到抗蟲效果較好的轉(zhuǎn)化植株; 武小霞等[18]將基因轉(zhuǎn)入黑農(nóng)35中, 檢測(cè)得到抗大豆食心蟲轉(zhuǎn)基因植株; 朱延明等[19]將具有豆莢特異性啟動(dòng)子Pmsg的29基因轉(zhuǎn)入綏農(nóng)28中, 獲得了對(duì)鱗翅目和雙翅目都具有抗性植株; 藍(lán)嵐等[20]將抗蟲基因轉(zhuǎn)入東農(nóng)50中, 證明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大豆食心蟲具有明顯抗性; 高嵩[21]將抗蟲基因轉(zhuǎn)入到吉農(nóng)28中發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)大豆食心蟲具有明顯抗性; 美國孟山都公司、陶氏公司將、等目的基因?qū)氪蠖怪? 獲得對(duì)鱗翅目類昆蟲具有強(qiáng)烈殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆品種, 并在加拿大、日本、美國展開商業(yè)化種植[22-24]。但抗蟲基因?qū)儆谕庠椿? 轉(zhuǎn)抗蟲基因大豆對(duì)非靶標(biāo)生物造成了潛在的威脅。因此, 需鑒定出大豆自身含有的抗蟲目的基因并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化, 獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因材料。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起, 基于全基因組測(cè)序的BSA方法在不構(gòu)建遺傳圖譜的情況下能高效快速地挖掘目標(biāo)性狀基因, BSA-Seq方法已被廣泛應(yīng)用在水稻、黃瓜、番茄、大豆等作物中, 并且成功地定位出水稻耐鹽[25]、水稻稻瘟病[26]、黃瓜早花[27]、番茄果實(shí)重量[28]、大豆疫霉病[29]等基因。本研究利用高抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2與高感材料皖82-178雜交構(gòu)建F2代分離群體, 通過對(duì)親本和2個(gè)極端表型子代混合池進(jìn)行BSA-Seq全基因組重測(cè)序, 定位目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)區(qū)域, 推測(cè)與抗豆卷葉螟有關(guān)的基因; 再結(jié)合前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果, 關(guān)注抗蟲性狀候選區(qū)域的相關(guān)基因的表達(dá)水平, 進(jìn)一步縮小候選基因范圍, 鑒定出控制豆卷葉螟性狀的候選基因, 旨在為更深入的闡明大豆抗豆卷葉螟的分子機(jī)制開拓新思路, 為大豆的抗蟲分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年利用皖82-178 (高感豆卷葉螟)為母本和趕泰-2-2 (高抗豆卷葉螟)為父本進(jìn)行雜交, 試驗(yàn)材料(F2代群體和親本材料)于2020年3月種植在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本部試驗(yàn)田防蟲網(wǎng)室中(東經(jīng)108.1146°、北緯22.5059°, 紅壤土), 壟長1.5 m、行距0.5 m, 3行區(qū)播種, 每行10株, 在大豆整個(gè)生育期期間不噴施農(nóng)藥, 不施用肥料。待植株長至10片復(fù)葉時(shí), 按每株3蟲的密度分別接豆卷葉螟4齡幼蟲3頭(用鑷子取3頭蟲接到第9片復(fù)葉的中間小葉上), 48 h后以卷包數(shù)和卷葉率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行抗性鑒定(卷葉率0～10%為高抗、10%～30%為抗、30%～50%為中抗、50%～70%為感、>70%為高感)[7-8]。從303個(gè)F2分離群體中挑選30株極端抗豆卷葉螟單株和30株極端感豆卷葉螟單株構(gòu)建子代高抗混合池和高感混合池, 用于抗豆卷葉螟的基因定位。田間采集相應(yīng)植株幼嫩葉片。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用改良CTAB法[30]分別提取親本材料(趕泰-2-2和皖82-178)和F2代群體極端個(gè)體的DNA, 將極端抗豆卷葉螟植株幼嫩葉片和極端感豆卷葉螟植株幼嫩葉片各30株的DNA等量混合, 制備總DNA 3 μg, 樣品濃度≥20 ng μL-1, 構(gòu)建高抗子代混合池、高感子代混合池。

1.2.2 文庫構(gòu)建及測(cè)序 由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成樣本建庫和測(cè)序。將檢測(cè)合格的基因組DNA樣本用Covaris儀超聲波隨機(jī)打斷成特定大小的片段, 打斷后的樣本用Agencourt AMPure XP-Medium kit進(jìn)行片段選擇, 使得樣本條帶集中在200～300 bp左右, 使用試劑盒Qubit dsDNA HS AssayKit, 500 assays檢測(cè)純化后DNA樣本量; 對(duì)打斷的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù), 在3￠端連接A堿基, 將特定測(cè)序引物連接到DNA片段上; 純化連接產(chǎn)物, 選擇合適大小的DNA片段; 將DNA片段在cBot儀器上擴(kuò)增制備文庫; 對(duì)構(gòu)建的文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè); 將質(zhì)量檢測(cè)合格的文庫上機(jī)測(cè)序。對(duì)親本池和子代混合池分別開展20×和50×覆蓋度的全基因組重測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)測(cè)序得到的Raw reads進(jìn)行過濾, 將過濾后的Clean reads運(yùn)用BWA軟件與大豆參考基因組進(jìn)行比對(duì)[31-32], 將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序、質(zhì)量過濾和標(biāo)記duplicate后進(jìn)行變異類型檢測(cè)。使用GATK軟件查找樣本相對(duì)于參考基因組之間的SNP, 用Breakdancer[33]軟件來檢測(cè)樣本與參考基因組之間的SV位點(diǎn), 用Control-FREEC[34]軟件來查找樣本相對(duì)于參考基因組之間的CNV區(qū)域。為得到更準(zhǔn)確的變異信息, 對(duì)變異位點(diǎn)分別進(jìn)行進(jìn)一步的過濾, 使用變異位點(diǎn)注釋軟件Annovar[35]將變異位點(diǎn)在基因組上的位置區(qū)域注釋出來。

1.2.4 SNP-index計(jì)算 子代群體與親本之間的序列差異程度用SNP-index來表示, 計(jì)算經(jīng)過質(zhì)量控制后的每一個(gè)變異位點(diǎn)在高抗子代池和高感子代池中的SNP-index, 過濾掉2個(gè)子代極端混合池里面SNP-index都小于0.3的位點(diǎn), 只保留雙親純合且有差異、子代混池都為非缺少的SNP位點(diǎn)。同時(shí), 將2個(gè)子代池的SNP-index相減得到Delta SNP-index。Delta SNP-index為1或者-1, 說明相對(duì)應(yīng)的SNP來源于其中一個(gè)親本, 這一位點(diǎn)所在的基因很有可能是與目的性狀相關(guān)的基因。

1.2.5 目的基因的篩選與功能注釋 使用滑窗法對(duì)滑窗內(nèi)的Delta SNP-index進(jìn)行計(jì)算, 取滑窗內(nèi)所有SNP位點(diǎn)的Delta SNP-index的平均值, 滑窗大小為1.00 Mb, 步長為0.05 Mb, 對(duì)Delta SNP-index在各染色體上的分布進(jìn)行作圖?；诨蚪MGff注釋文件, 對(duì)所有候選位點(diǎn)進(jìn)行來源注釋, 挑選出位于基因區(qū)的SNP位點(diǎn), 為縮小篩選范圍, 選取99%置信區(qū)間作為篩選閾值, 單獨(dú)把Delta SNP-index大于99%置信區(qū)間的SNP位點(diǎn)篩選出來進(jìn)行注釋。利用Blast2go_v2.5軟件對(duì)所鑒定的基因進(jìn)行GO注釋分析, 計(jì)算得到的-value通過Bonferroni校正之后, 以Corrected-value≤0.05為閾值。利用Blast_v2.2.26軟件在KEGG pathway數(shù)據(jù)庫對(duì)所鑒定的基因進(jìn)行Pathway富集分析, 計(jì)算得到的- value通過Bonferroni校正之后, Corrected-value≤0.05為閾值。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組分析 利用TRIzol Kit提取葉片總RNA, 采用Truseq RNA試劑盒進(jìn)行mRNA純化并構(gòu)建cDNA文庫, 對(duì)獲得的cDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集, 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 回收目的片段。然后使用Illumina Hiseq 2000測(cè)序儀進(jìn)行對(duì)樣本測(cè)序。以上試驗(yàn)均由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。測(cè)序后的數(shù)據(jù)經(jīng)Base calling轉(zhuǎn)化為Raw data或Raw reads, 隨后對(duì)Raw reads進(jìn)行質(zhì)控。利用SOAPfuse軟件[36]對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行去除處理得到Clean reads。再利用Tophat將Clean reads比對(duì)到大豆參考基因組, 允許有2個(gè)堿基的錯(cuò)配[37-38]。表達(dá)定量的結(jié)果以FPKM (Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)為單位, 在得到差異檢驗(yàn)的FDR值同時(shí), 根據(jù)基因的表達(dá)量(FPKM值)計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。以“FDR≤0.001和|log2Ratio (FC, Fold Change)|≥1”作為閾值來判斷基因差異表達(dá)的顯著性[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)親本及子代混合池共4個(gè)樣本進(jìn)行全基因組重測(cè)序, 共產(chǎn)生194.54 G原始測(cè)序數(shù)據(jù), 經(jīng)過SOAPnuke軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭過濾、低質(zhì)量過濾和去N過濾后, 最終得到191.35 G高質(zhì)量的Clean Reads數(shù)據(jù)。GC含量在35.46%～ 35.60%之間, 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高(Q20≥96.29%, Q30≥91.70%) (表1)。由此可知4個(gè)樣本的數(shù)據(jù)量充足, 測(cè)序數(shù)據(jù)可靠, 測(cè)序質(zhì)量合格, GC分布正常, 可進(jìn)行下一步分析。

使用BWA軟件(https://webblast.ipk-gatersleben. de/barley_ibsc/downloads/), 將4個(gè)樣本中質(zhì)控后的Clean reads比對(duì)到大豆參考基因組上, 然后使用Qualimap軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。其中, 基因組大小是979,046,046 bp, 有效基因組大小為955,932,237 bp (參考序列中不含N), 參考基因組GC含量為33.95%, 4個(gè)樣本的比對(duì)率介于99.76%和99.81%之間, 平均測(cè)序深度在30.78×和65.98×之間浮動(dòng)(表2)。數(shù)據(jù)比對(duì)率高, 有利于下一步進(jìn)行SNP檢測(cè)。

將測(cè)序Reads比對(duì)到參考基因組以后, 統(tǒng)計(jì)參考基因組上不同染色體區(qū)域的覆蓋度和測(cè)序深度分布情況。1×覆蓋率百分比超過95.75%, 5×覆蓋率百分比超過94.55%, 10×覆蓋率百分比超過93.29%, 20×覆蓋率百分比超過83.88% (表2)。通過Qualimap軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 參考基因組被均勻覆蓋, 隨機(jī)性良好, 有利于SNP過濾和篩選。

表1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

表2 質(zhì)控后測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

2.2 SNP檢測(cè)和注釋

SNP分析結(jié)果顯示, 4個(gè)樣本中共獲得11,963,077個(gè)SNP位點(diǎn), 其中高感子代混合池中最少, 皖82-178 (高感親本)中最多。SNP位置和編碼信息統(tǒng)計(jì)顯示, 同類型材料間(親本間, 子代池間)相同類型的SNP數(shù)和比例大體相當(dāng)(表3)。純合突變SNP比率明顯高于雜合突變SNP比率, 純合突變SNP 比率均高于99.73%。

2.3 候選基因篩選

利用SNP-index方法對(duì)檢測(cè)到的SNP進(jìn)行分析, 4個(gè)樣本共鑒定出高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)11,963,077個(gè)。根據(jù)SNP-index方法關(guān)聯(lián)閾值判斷, 所有候選位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因數(shù)量為56,909個(gè), 當(dāng)擬合后Delta SNP-index置信度為99%時(shí), 20條染色體上共有329個(gè)基因位于99%置信區(qū)間外, 主要集中在7號(hào)染色體5,601,065～5,865,237 bp區(qū)間(總長為0.26 Mb, 區(qū)間內(nèi)基因數(shù)量為25個(gè))、16號(hào)染色體2,975,110～6,336,096 bp區(qū)間(總長為3.36 Mb, 區(qū)間內(nèi)基因數(shù)量為36個(gè))、18號(hào)染色體44,366,115～ 54,297,600 bp區(qū)間(總長為9.93 Mb, 區(qū)間內(nèi)基因數(shù)量為52個(gè))等區(qū)域內(nèi), 區(qū)間內(nèi)共包含113個(gè)基因(圖1)。1號(hào)染色體和19號(hào)染色體上沒有檢測(cè)到基因, 2號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)和12號(hào)染色體上檢測(cè)到的基因數(shù)少于10個(gè)。

表3 多態(tài)性位點(diǎn)注釋統(tǒng)計(jì)表

為進(jìn)一步分析基因所在的亞細(xì)胞定位、分子功能及參與的生物學(xué)過程, 對(duì)所鑒定出的329個(gè)基因進(jìn)行GO功能注釋分析表明, 329個(gè)基因中有181個(gè)被注釋到20個(gè)功能組中(圖2), 包括9個(gè)生物學(xué)進(jìn)程、7個(gè)細(xì)胞組分和4個(gè)分子功能, 在生物學(xué)進(jìn)程中, 這些基因主要參與刺激反應(yīng)、單一生物體過程、代謝過程、細(xì)胞過程等生物學(xué)過程; 在細(xì)胞組分中, 這些基因主要集中在細(xì)胞、細(xì)胞組分、膜、膜組分等組分; 在分子功能中, 這些基因主要參與結(jié)合、催化活性等功能。說明蟲害脅迫下大豆對(duì)逆境的響應(yīng)可能與細(xì)胞組織、細(xì)胞膜組織等的修復(fù)功能有關(guān), 且一些催化活性的酶可能參與到蟲害逆境脅迫中。

為鑒別329個(gè)基因參與富集的代謝途徑, 利用KEGG通路數(shù)據(jù)庫對(duì)候選基因進(jìn)行Pathway富集分析表明, 329個(gè)基因中有30個(gè)基因主要富集在植物病原菌互作、代謝途徑、次生代謝物的生物合成、RNA降解等通路中(圖3)。表明當(dāng)大豆受到豆卷葉螟危害以后, 植株體內(nèi)的防御系統(tǒng)會(huì)立即響應(yīng)刺激, 適當(dāng)?shù)卦黾芋w內(nèi)的代謝活動(dòng), 產(chǎn)生防御物質(zhì), 如防御酶、蛋白質(zhì)抑制酶等物質(zhì), 而且增強(qiáng)各種酶的活性來促進(jìn)防御。

橫坐標(biāo)為染色體編號(hào), 縱坐標(biāo)為Delta SNP-index值。不同顏色的點(diǎn)表示不同染色體上篩選后的SNP, 紅色曲線表示滑窗后的Delta SNP-index值, 藍(lán)色直線表示99%置信區(qū)間值。

The X-axis is the chromosome number, Y-axis is the Delta SNP-index value. Different colored dots represent SNPs screened on different chromosomes, the red curve represents the Delta SNP-index value after the sliding window, the blue line represents the 99% confidence interval.

將BSA-Seq結(jié)果預(yù)測(cè)的基因和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[13]進(jìn)行聯(lián)合分析, 將位于99%置信區(qū)間以外SNP對(duì)應(yīng)的基因與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì), 獲得轉(zhuǎn)錄組中的同源序列及基因的表達(dá)水平。比對(duì)發(fā)現(xiàn)共有12個(gè)基因在4個(gè)比較組中呈顯著性差異表達(dá), 這些基因分別位于2號(hào)、12號(hào)、16號(hào)、18號(hào)等9條染色體上(表4), 其中響應(yīng)豆卷葉螟取食脅迫誘導(dǎo)的基因有8個(gè), 這8個(gè)基因中共有7個(gè)為顯著上調(diào)基因, 分別為環(huán)核苷酸門控離子通道4 ()、轉(zhuǎn)錄因子、赤霉素2-β加雙氧酶8、氨基酸透性酶7 ()、Mdis1相互受體激酶2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、, 只有纖維素合成酶A催化亞基4 ()為顯著下調(diào)基因; 類枯草桿菌蛋白酶、抗病蛋白R(shí)GA3和硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域蛋白酶10等3個(gè)基因在高感材料中的表達(dá)量顯著高于高抗材料, 1個(gè)未知基因在在高感材料中的表達(dá)量顯著低于高抗材料。最后, 結(jié)合基因的同源注釋、基因差異表達(dá)分析和生物信息學(xué)分析等, 推測(cè)環(huán)核苷酸門控離子通道4 ()、轉(zhuǎn)錄因子、7、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、等12個(gè)基因?yàn)榭苟咕砣~螟有關(guān)的候選基因。

3 討論

基于BSA-Seq的方法挖掘新基因在作物農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因定位中的應(yīng)用日益廣泛, 該方法在構(gòu)建遺傳圖譜的情況下高效快速地挖掘目的基因[40], 是一種簡單快速、準(zhǔn)確的基因定位方法, 已成為育種家進(jìn)行快速Q(mào)TL定位和挖掘各種不同作物目標(biāo)性狀基因的一種有效方法。如Takagi等[25]利用BSA-Seq方法找到控制水稻耐鹽性的候選基因, 僅用2年時(shí)間培育出水稻耐鹽性新品種; Lu等[27]利用BSA-Seq方法定位到84個(gè)控制黃瓜早花性狀基因并確定基因?yàn)楹蜻x基因; Illa- Berenguer等[28]利用BSA-Seq方法定位到66個(gè)控制番茄果實(shí)重量性狀基因; Guo等[41]利用BSA-Seq方法快速定位到29個(gè)辣椒抗黃瓜花葉病毒性狀基因并挖掘出2個(gè)候選基因; Ma等[42]利用BSA-Seq方法定位到控制水稻低柱頭外露突變候選基因; Zhao等[43]利用BSA-Seq方法鑒定到20個(gè)棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)候選基因; 張堯鋒等[44]利用BSA-Seq方法在甘藍(lán)型油菜中定位到8個(gè)控制有限花序性狀候選基因。BSA-Seq方法也被用于農(nóng)作物的抗蟲基因定位, Liang等[45]利用BSA-Seq方法定位到1個(gè)與黃瓜蚜蟲抗性相關(guān)的區(qū)域, 該區(qū)域內(nèi)包含40個(gè)基因, 其中16個(gè)基因可能與蚜蟲抗性有關(guān)。利用全基因組重測(cè)序與BSA相結(jié)合同樣能夠高效和快速鑒定大豆中的目標(biāo)性狀基因[46], 本研究利用BSA-Seq分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析對(duì)控制抗豆卷葉螟性狀相關(guān)基因進(jìn)行了初步定位, 篩選出12個(gè)可能與抗豆卷葉螟脅迫相關(guān)的候選基因, 再結(jié)合生物信息學(xué)分析、基因差異表達(dá)分析和基因同源性分析發(fā)現(xiàn), 環(huán)核苷酸門控離子通道4 ()、轉(zhuǎn)錄因子、氨基酸透性酶7 ()、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、、類枯草桿菌蛋白酶等6個(gè)基因已有報(bào)道與抗逆有關(guān)。而赤霉素2-b加雙氧酶8、Mdis1相互受體激酶2、抗病蛋白R(shí)GA3、硫氰酸酶結(jié)構(gòu)域蛋白酶10和1個(gè)未知基因可能是與抗大豆卷葉螟有關(guān)的新基因。

表4 候選基因信息表

HR代表抗豆卷葉螟材料趕泰-2-2和HS為高感豆卷葉螟材料皖82-178。數(shù)字0和48代表處理時(shí)間為0 h和48 h。a上調(diào)或者下調(diào)代表顯著性上調(diào)或者顯著性下調(diào)。

HR represents the highly resistant material Gantai-2-2, HS represents the highly susceptible material Wan 82-178. The numbers 0 and 48 represent the processing time of 0 hour and 48 hours.aThe ‘up’ or ‘down’ represents significantly different up or down.

環(huán)核苷酸門控離子通道()是一種非選擇性的陽離子通道, 對(duì)一價(jià)和二價(jià)陽離子均有通透性, 是動(dòng)植物細(xì)胞中非常重要的離子通道, 在植物生長發(fā)育、生物與非生物脅迫中都發(fā)揮著重要作用[47-48]。植物細(xì)胞中,是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的組成部分, 是環(huán)核苷酸作用的一個(gè)主要靶標(biāo), 是連接環(huán)核苷酸和Ca2+的紐帶。在病原菌入侵的早期, 它能夠參與Ca2+內(nèi)流的調(diào)控[49-50], 將細(xì)胞外信號(hào)通過陽離子流轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號(hào), 對(duì)細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控[51]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí), 定位于細(xì)胞膜上的受體蛋白識(shí)別相應(yīng)刺激, 并激活胞質(zhì)內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶, 生成的環(huán)核苷酸(cAMP)使通道打開, 胞外Ca2+內(nèi)流[52]。轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 在調(diào)控植物的生長發(fā)育、生物及非生物脅迫等過程中具有十分重要的作用[53-55]。植物遭受昆蟲脅迫后, 植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化[56], 如擬南芥受到線蟲危害時(shí),基因被誘導(dǎo)[57]。氨基酸透性酶()是植物中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要作用[58-59]?；蛟谥参锏钟≡w侵害方面扮演著重要的角色, 如含基因和基因突變體植株能維持根結(jié)線蟲生長率低于野生型[60]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是一類重要的信號(hào)分子, 當(dāng)植物遭遇到如害蟲取食、鹽害、干旱等脅迫, 或是受到創(chuàng)傷以及其他細(xì)胞因子、激素刺激時(shí), 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶迅速在絲氨酸、蘇氨酸殘基部位磷酸化而激活, 并進(jìn)一步通過級(jí)聯(lián)磷酸化作用活化下游的信號(hào)分子, 激活特定的信號(hào)傳導(dǎo)途徑, 最終將外界信號(hào)傳遞到細(xì)胞核, 激活或抑制特定基因的表達(dá)[61-63]?；虻谋磉_(dá)對(duì)植物株型發(fā)育有重要的調(diào)控作用, 該基因的表達(dá)水平受植物激素和光照的調(diào)節(jié), 最終導(dǎo)致植物株型的變化[64]。類枯草桿菌蛋白酶是一類在植物發(fā)育和信號(hào)級(jí)聯(lián)中實(shí)現(xiàn)高度特異性功能的絲氨酸蛋白酶, 在植物和病原物互作過程中起到重要的免疫激發(fā)作用[65]。推測(cè)以上候選基因的功能和參與的代謝途徑可能與大豆抗豆卷葉螟有關(guān), 當(dāng)大豆受豆卷葉螟誘導(dǎo)脅迫后, 一些候選基因能發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、相關(guān)基因表達(dá)及防御物質(zhì)生成等一系列的反應(yīng)來抵御蟲害。大豆抗豆卷葉螟是一個(gè)復(fù)雜的生理過程, 目前尚缺乏遺傳調(diào)控方面的研究, 本研究中通過BSA-Seq技術(shù)與RNA-Seq技術(shù)相結(jié)合, 挖掘出一些與抗豆卷葉螟相關(guān)的候選基因, 對(duì)于這些基因是否是調(diào)控豆卷葉螟的關(guān)鍵基因, 以及其調(diào)控機(jī)理將在后續(xù)的工作中進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過BSA-Seq全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)共有329個(gè)基因位于99%置信區(qū)間以外, 主要集中在7號(hào)、16號(hào)和18號(hào)等染色體上。通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析、基因的同源注釋、生物信息學(xué)分析等, 初步推測(cè)、轉(zhuǎn)錄因子、7、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、等12個(gè)基因?yàn)榇蠖箍苟咕砣~螟相關(guān)的候選基因, 這些基因可能在大豆抗豆卷葉螟過程中起著重要作用, 為大豆抗豆卷葉螟基因圖位克隆奠定了基礎(chǔ)。

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Identification of the candidate genes of soybean resistance to bean pyralid (Fabricius) by BSA-Seq and RNA-Seq

ZENG Wei-Ying**, LAI Zhen-Guang**, SUN Zu-Dong*, YANG Shou-Zhen, CHEN Huai-Zhu, and TANG Xiang-Min

Institute of Economic Crops, Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Southwest Experimental Station of Maize-Soybean Intercrop, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanning 530007, Guangxi, China

Bean pyralid is an important leaf-feeding insect in soybean. Identification of insect-tolerant genes from soybean has great significant to the crop insect-tolerant breeding and genetic improvement. In this study, an F2population with 303 individuals was constructed using insect-resistant line Gantai-2-2 and insect-sensitive line Wan 82-178. 30 F2insect-resistant individuals and 30 insect-sensitive individuals were selected respectively to construct two DNA pools which were used for the whole-genome re-sequencing. The results showed that there were a total of 11,963,077 single nucleotide polymorphism (SNPs) markers identified in two parental lines and two mixed pools. According to the association analysis of SNP-index method, a total of 329 genes were located outside the 99% confidence interval. These genes were mainly concentrated in the regions of 5,601,065–5,865,237 bp with a total of 0.26 Mb on chromosome 7, 2,975,110–6,336,096 bp with a total of 3.36 Mb on chromosome 16, and 44,366,115–54,297,600 bp with a total of 9.93 Mb on chromosome 18. Correlation analysis of BSA-Seq and transcriptome sequencing showed that 12 genes were correlated. Then, 12 candidate genes, including,transcription factor 16,7, serine/threonine protein kinase andwere identified by bioinformatics analysis, differential expression analysis, and homologous annotation. This study laid an important foundation for the analysis of the molecular mechanism of soybean resistance to bean pyralid and the cloning of anti-insect genes.

soybean; bean pyralid; BSA-Seq; RNA-Seq; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2021.04195

本研究由廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017GXNSFDA198037)和廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目(桂農(nóng)科2020YM116, 2015YT58)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Guangxi Province, China (2017GXNSFDA198037) and the Science and Technology Development Fund of Guangxi Academy of Agricultural Sciences (Guinongke 2020YM116, 2015YT58).

孫祖東, E-mail: sunzudong639@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

曾維英, E-mail: zengweiying_1981@163.com; 賴振光, E-mail: 519229671@qq.com

2020-08-25;

2021-01-13;

2021-02-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210216.1414.002.html