李瑋,宋國琦,商航,李玉蓮,張淑娟,張榮志,李吉虎,高潔,李根英
(1.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室,山東 濟南 250100;2.新疆農(nóng)業(yè)大學科學技術學院,新疆 烏魯木齊 830052)
小麥是復雜的異源六倍體物種,其基因組約為17 Gb[1],是水稻的36倍多、玉米的7倍多。巨大的基因組給基因克隆和基因功能分析帶來重重困難,是導致小麥分子育種滯后于水稻和玉米的原因之一。2012年Liu等[2]系統(tǒng)總結(jié)了小麥中已克隆的30多個功能基因或遺傳位點及其相關的97個功能標記,主要涉及小麥加工品質(zhì)、農(nóng)藝性狀和抗病性。功能標記是根據(jù)功能基因上的等位變異開發(fā)的分子標記,不同于連鎖標記,不會因為染色體交換導致標記與表型不符,是用于分子標記輔助選擇的理想標記。這97個功能標記主要為STS、SCAR和CAPS,需要通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測,較為費時費力。2016年Rasheed等[3]報道了70個小麥KASP功能標記,相比需要通過凝膠電泳進行檢測的分子標記,通過熒光檢測的KASP標記檢測速度提高了45倍。2017年國際小麥基因組測序聯(lián)盟提前釋放了中國春參考基因組序列,為小麥功能基因研究鋪平了道路。2019年Khalid等[4]報道了小麥中已克隆功能基因或遺傳位點增加到87個,對應的KASP標記數(shù)量也增加到124個。隨著越來越多的KASP功能標記被開發(fā),功能標記也逐漸被應用。2019年Zhao等[5]對來自全球的1 152份小麥材料進行了47個基因的KASP標記檢測分析,粒重、抗旱、黃色素、穗發(fā)芽和株高相關的幾個基因優(yōu)異等位變異占比較高,而抗病相關的Lr68、Fhb1、Yr15和品質(zhì)相關的Wx-B1優(yōu)異等位變異占比較低,可作為未來改良的目標。2020年單子龍等[6]利用22個品質(zhì)相關的KASP功能標記對153份河北省歷年審定的小麥品種進行了檢測,僅有5個基因的優(yōu)異等位變異占比超過60%,7個基因的優(yōu)異等位變異占比低于10%,表明通過輔助選擇優(yōu)異等位變異改良河北省小麥品質(zhì)性狀仍有力可為。2020年王志偉等利用抗?。?]、株高和粒重[8]相關的KASP標記對云南省42份小麥品種(系)進行了檢測,絕大部分基因的優(yōu)異等位變異占比較低,仍有遺傳改良潛力。2021年Zhang等[9]對寧夏自治區(qū)種植的小麥地方品種、現(xiàn)代品種(系)和引進品種共207份進行了44個KASP標記檢測,與粒重、硬度、黃色素、株高等相關的幾個基因優(yōu)異等位變異占比較高,其他大部分基因的優(yōu)異等位變異占比有待提高。
現(xiàn)代育種技術已經(jīng)從傳統(tǒng)經(jīng)驗育種向精準育種轉(zhuǎn)變,通過提高與育種目標相關功能基因優(yōu)異等位變異的占比可以促進育種基礎的提高,功能基因的分子標記輔助選擇對小麥分子育種意義重大。山東省是我國小麥生產(chǎn)大省,為了促進小麥分子育種技術在山東的發(fā)展和應用,了解山東省小麥優(yōu)異等位變異占比情況,本研究從課題組保存的小麥育種親本出發(fā),選擇部分分型效果較好的KASP功能標記進行檢測,旨在明確功能基因優(yōu)異等位變異在育種親本材料中的占比,促進山東省小麥育種單位利用小麥分子標記輔助選擇進行遺傳改良。
本研究選用的小麥材料(表1)是本課題組收集保存用于育種的小麥品種或高代品系,共94份。2019年11月播種于山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所濟南試驗基地。播種機點播,行距33 cm,行長2 m,株距5 cm,按行長劃排,排間留1 m的田間走道。
于小麥抽穗期取2 cm左右旗葉,液氮冷凍,用Geno/Grinder 2010組織研磨機(SPEX,美國)進行研磨,800 r/min研磨20 s。用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA,去離子水溶解,調(diào)整濃度至100 ng/μL。
KASP反應體系和反應程序均參考Rasheed等[3]的,所用42個KASP標記引物序列來自Rasheed[3]、Khalid[4]和高潔[10]等,引物由青島擎科生物技術有限公司合成。KASP Master Mix購自LGC公司(北京)。使用PHERAstar SNP分型檢測儀(LGC,英國)檢測KASP反應最終熒光顏色,檢測結(jié)果導入Kluster Caller軟件進行分型。基因名稱和相應基因標記名稱見表2。
表1 參試小麥品種(系)
表2 基因名稱和相應基因標記名稱
本研究共檢測了42個KASP標記,基本上所有標記都能較好地分型(圖1)。除TaGS2B1_1936檢測缺失數(shù)據(jù)為15個外,其余標記的缺失數(shù)據(jù)均較少(圖2),平均每個標記的缺失數(shù)據(jù)個數(shù)為2.4?;虻膬?yōu)異等位變異占比從0至100%,優(yōu)異等位變異占比低于10%的有7個基因,高于80%的有11個。
圖1 部分KASP標記檢測結(jié)果
圖2 94份小麥材料的等位變異占比
選擇1RS∶1BL_6110檢測1B/1R易位,94份參試小麥材料中28份含有1B/1R易位,占比30%。1RS染色體同時含有抗病基因和不利品質(zhì)的黑麥堿基因,在本研究中將含有1B/1R易位列入優(yōu)異等位變異。含有優(yōu)異等位變異的材料有魯原502、周麥22、周8425B、北京841、濮麥053、內(nèi)鄉(xiāng)188、HM-1、濟寧12、西農(nóng)511、周麥36、周麥38、JM268、德05-10、華麥1號、寧麥11、淮麥20、寧 洪17237、17J218、17J236、JN331、科 農(nóng)3106、菏麥0662、菏麥0746-2、漯抗2號、K35、山農(nóng)0713-2、山農(nóng)多粒1號、山融3號。
對Rht-B1和Rht-D1兩個株高基因進行了KASP標記檢測,分別有17份和75份材料含有矮稈等位變異,占比為18%和80%。同時含有兩個矮稈基因的有3份材料,分別是豫麥47、周8425B和金麥1號。不含上述兩個矮稈基因的材料是京411和北京841。
檢測了9個產(chǎn)量相關的KASP標記。千粒重相關的TaCwi、GW2-6B-721SNP和Sus1-7B-2932IND優(yōu)異等位變異占比較高,分別是89%、100%和94%,而TaGS2B1_1936、GS5-2334、TaGW2-6A優(yōu)異等位變異占比較低,分別是33%、44%和23%;TaGASR是粒長的KASP標記,優(yōu)異等位變異占比為10%;TEF7A1_606是小穗粒數(shù)的KASP標記,優(yōu)異等位變異占比38%;TaMoc-2433是穗數(shù)的KASP標記,優(yōu)異等位變異占比僅為5%。參試小麥材料中,山融3號含有除TaMoc-2433外的8個優(yōu)異等位變異,是含有產(chǎn)量相關優(yōu)異等位變異最多的材料;其次是山農(nóng)9540-55,含有除TaMoc-2433和TEF7A1_606的7個優(yōu)異等位變異。同時含有TaMoc-2433和TEF7A1_606優(yōu)異等位基因的材料有西農(nóng)511和科農(nóng)3106。
檢測了9個與品質(zhì)相關的KASP標記。GluA1.1_1883和GluD1_4777是高分子量麥谷蛋白亞基2*/1和(5+10)標記,分別占68%和28%,參試小麥材料中濟麥20、鄭麥366、冀師02-1、洲元9369、藁優(yōu)5766、煙農(nóng)1212、煙農(nóng)999、HM-1、硬B2 16-6、濟寧12、濟麥229、濟麥44、中麥578、新麥9、華麥1號、寧麥11、漯抗2號、山農(nóng)0538、山農(nóng)24、山農(nóng)25同時含有優(yōu)異亞基2*/1和(5+10);脂肪氧化酶標記LoxB1_SNP的低酶活優(yōu)異等位基因占比70%,含有脂肪氧化酶優(yōu)異等位變異的材料較多;與硬度相關的Pina-D1_INS、Pinb2-v2-3和Pinb-D1_INS的優(yōu)異等位變異占比分別為5%、51%和72%,一般小麥中硬度優(yōu)異等位變異僅含Pina-D1和Pinb-D1其中一個,本研究中含有Pina-D1優(yōu)異等位變異的材料較少,冀師02-1、Manital和藁優(yōu)5766同時含有Pina-D1和Pinb2-V優(yōu)異等位變異;與黃色素相關的Zds-A1_SNP、ZDS-D1_SNP和Pds-B1_2002的優(yōu)異等位變異占比分別為26%、99%和22%,同時含有三個黃色素優(yōu)異等位變異的材料有新麥26、內(nèi)鄉(xiāng)188、濟寧12和山農(nóng)29。
檢測了12個與抗性相關的KASP標記??钩嗝共〉腇hb1的snp3BS-8檢測陽性材料僅有山農(nóng)抗赤1號,占比1%;抗小麥黃花葉病的Sbmp_6061檢測陽性占比5%,有煙農(nóng)19、硬B2 16-6、濟糯麥1號、漯抗1號和山農(nóng)25;未檢測到Pm21陽性材料;抗葉銹的ubw14和Lr68-2檢測陽性占比分別是50%和15%,兼抗條銹、葉銹和白粉的多效抗病基因標記C6K2C1、Sr2K3和Lr46g22K3檢測陽性占比分別是0、0和93%,ubw14、Lr68-2和Lr46g22K3均為陽性的材料有京411、北京841、陜7859、煙農(nóng)1212、煙農(nóng)999、濟寧12、濟麥60、西農(nóng)511、德05-10、華麥1號、淮麥20、17J218、山融3號;抗旱的1fehw3檢測陽性材料占比66%,含有該基因的材料較多;抗穗發(fā)芽的TaSdr-B1和PHS1-prom-222優(yōu)異等位變異占比分別為21%和51%,Vp1B1有a、b、c三個等位變異,等位變異a不抗穗發(fā)芽,等位變異b和c抗穗發(fā)芽,Vp1B2-83不能區(qū)分a和b,故本研究中將c作為優(yōu)異等位變異,占比51%,同時含有Vp1B2-83和PHS1-prom-222優(yōu)異等位變異的材料有洲元9369和華麥1號,同時含有TaSdr-B1和Vp1B2-83優(yōu)異等位變異的材料有陜7859、藁優(yōu)5766、內(nèi)鄉(xiāng)188、中麥578、寧麥11、科農(nóng)3106、漯抗1號、漯抗2號、K35、山農(nóng)0538、山農(nóng)抗赤1號、山農(nóng)特大粒1號、山融3號。
檢測了6個與春化、光周期相關的KASP標記。光周期標記GS105-1117IND、TaPpdBJ001和TaPpdDD001優(yōu)異等位變異占比分別為99%、73%和98%;春化基因標記Exon7_C/T_Vrn-A1、Vrn-B1_B、Vrn-D1-D1a_A優(yōu)異等位變異占比分別為85%、96%和80%。光周期和春化基因決定了小麥的生態(tài)適應性,因此相同生態(tài)區(qū)的小麥主效基因的等位變異基本上是一致的且占比很高。
檢測了3個與開花期相關的KASP標記。開花期的優(yōu)異等位變異與生態(tài)區(qū)有關,本研究中將檢測數(shù)量較多的等位變異作為優(yōu)異等位變異。TaFT3-B1、TaELF3-B1和PRR73A1-9IND優(yōu)異等位變異的占比分別為67%、98%和81%。
1B/1R易位系小麥品種具有適應性好、耐后期高溫、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)點[11],這主要得益于1RS染色體上攜帶有Lr26、Sr31、Yr9和Pm8等抗病基因和其他高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)基因或基因組合[12]。1B/1R易位系被作為優(yōu)異親本廣泛利用,是外源基因用于小麥品種改良最成功的范例[13],選擇是否攜帶1RS染色體最簡便有效的方法就是分子標記輔助選擇。近期,Qi等[14]提出了作物育種“布達拉”模型,首先將品種的優(yōu)良性狀和優(yōu)異基因定向聚集,這就需要通過功能標記輔助選擇來實現(xiàn)。小麥中已經(jīng)克隆的功能基因相對較少,如何利用功能標記輔助選擇將這些已克隆的功能基因用于育種是當務之急。雖然國內(nèi)有關親本基因型檢測的報道不少,但利用功能標記輔助選擇成功選育小麥品種還鮮有報道。加強對現(xiàn)有功能標記的利用,特別是育種親本中占比較低的優(yōu)異等位變異的利用對小麥改良有重要意義。本研究中與產(chǎn)量相關 的KASP標 記TaGASR、TaMoc-2433、TaGS2B1_1936、GS5-2334、TaGW2-6A,與品質(zhì)相關的KASP標記GluD1_4777、Zds-A1_SNP、Pds-B1_2002,與抗性相關的KASP標記snp3BS-8、Sbmp_6061、Lr68-2、C6K2C1、Sr2K3、TaSdr-B1在檢測的94份材料中優(yōu)異等位變異占比均較低,可作為未來小麥分子育種應用的重要方向。
SNP是基因組中最豐富的變異類型,是未來分子標記利用的方向,隨著越來越多功能基因被克隆,KASP功能標記數(shù)量也會逐步增加。KASP是檢測SNP最簡便靈活的技術,已被廣泛應用。除LGC公司專用的檢測儀器外,熒光定量PCR儀、熒光酶標儀等均可用于檢測KASP標記。2019年KASP功能標記數(shù)量已達124個[4],Zhao[5]、Zhang[9]等 分 別 選 擇 了47個 和44個KASP標記,本研究選用了42個標記,這是因為小麥基因組的復雜性導致將SNP轉(zhuǎn)化成KASP標記相對比較困難[15]。已開發(fā)的KASP標記可能還存在假陽性等問題[3],部分KASP標記的檢測結(jié)果不盡如人意,隨著KASP標記開發(fā)和應用的成熟,這些問題都有望得到解決[10,15]。