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        小麥鹽脅迫持續(xù)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子基因TaERF8-2D的克隆及其分析

        2021-06-09 03:45:14崔德周李永波隋新霞黃琛楊在東樊慶琦楚秀生
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:耐鹽磷酸化克隆

        崔德周,李永波,隋新霞,黃琛,楊在東,樊慶琦,楚秀生,3

        (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室,山東 濟(jì)南 250100;2.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司,山東 濟(jì)南 250100;3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014)

        鹽脅迫是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的全球性問題。據(jù)統(tǒng)計,全球約8.3億公頃的耕地遭受著土壤鹽漬化的侵蝕[1]。我國鹽堿地總面積約為3 600萬公頃,鹽脅迫每年造成的糧食減產(chǎn)達(dá)總產(chǎn)的15%以上[2]。小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一,也是鹽漬化土壤重要的栽培作物,其耐鹽性的高低直接決定是否能夠穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)。因此克隆小麥耐鹽基因,解析其對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制,對小麥耐鹽遺傳改良具有重要意義。

        轉(zhuǎn)錄因子是生物體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)蛋白,它們通過與啟動子區(qū)域的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合,直接調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[3]。AP2/EREBP(APETALA 2/ethylene-responsive element binding protein)類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,因含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域而得名。在擬南芥中,Sakuma[4]和張麒[5]等根據(jù)其序列相似性和AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的數(shù)量,將其分為AP2(APETALA 2)、RAV(related to ABI3/VP1)和EREBP(ethylene-responsive element binding protein)三大類型。EREBP型轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其在DNA結(jié)合區(qū)第14位和第19位的氨基酸序列差異,又可分為DREB(dehydration-responsive element binding protein)亞族和ERF(ethylene-responsive factor)亞族,其中DREB亞族第14位和第19位分別是纈氨酸和谷氨酸,而ERF亞族則是丙氨酸和天冬氨酸[4]。隨著基因組學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展,擬南芥、水稻、黃瓜、苜蓿等多種植物中ERF亞族的系統(tǒng)鑒定與分析被陸續(xù)報道[6-9]。

        ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5,10,11]。擬南芥ERF109通過介導(dǎo)茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長素合成通路間的交互作用,調(diào)控側(cè)根的發(fā)生[12]。過表達(dá)蘋果ERF3基因可促進(jìn)花青苷和原花青苷的積累[13]。大豆ERF3基因可被高鹽、干旱等誘導(dǎo)表達(dá),將其在煙草中過表達(dá)后,可顯著提高煙草對高鹽和干旱脅迫的耐受能力[14]。普通小麥中ERF類轉(zhuǎn)錄因子成員有47個[15],主要參與應(yīng)答生物或非生物逆境脅迫,然而,目前僅有少數(shù)幾個ERF基因被克隆,并進(jìn)行相應(yīng)的研究。研究表明,小麥ERF1基因的表達(dá)受高鹽、干旱、低溫、ABA、乙烯、水楊酸以及白粉病菌侵入的誘導(dǎo)[16];Zhu等克隆了受病原菌誘導(dǎo)的TaPIE1(pathogeninduced ERF1)基因,發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受紋枯病菌和低溫脅迫共同誘導(dǎo)[17];TaERF3基因除應(yīng)答高鹽和干旱脅迫外,對病原菌侵入和外源激素處理也有響應(yīng)[18,19];TaERF4基因在擬南芥中通過抑制液泡膜NHX活性,負(fù)調(diào)控耐鹽性[20];TaERF8-2B在調(diào)控普通小麥株高、抽穗期和千粒重中發(fā)揮重要作用[21],而TaERF8-2A和TaERF8-2D基因雖已被克隆,但尚未對其功能進(jìn)行解析,更未有在耐鹽小麥品種中進(jìn)行基因功能分析的報道。

        本研究利用本團(tuán)隊獲得的耐鹽小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從耐鹽小麥品種德抗961中克隆了鹽脅迫下持續(xù)上調(diào)的基因TaERF8-2D,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位和鹽脅迫下的基因表達(dá)分析,以期為深入研究該基因在小麥鹽脅迫中的耐鹽功能奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        本研究所用耐鹽小麥品種為德抗961,由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥種質(zhì)創(chuàng)新與利用團(tuán)隊保存。

        1.2 TaERF8-2D基因克隆及生物信息學(xué)分析

        利用本團(tuán)隊獲得的耐鹽小麥品種德抗961的轉(zhuǎn)錄組EST數(shù)據(jù),通過Ensembl小麥基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計獲得特異引物(F:5′-ATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′;R:5′-TCACGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′),以德抗961幼苗葉片cDNA為模板,擴(kuò)增TaERF8-2D基因的CDS序列。PCR擴(kuò)增程序:95℃5 min;95℃30 s,50℃30 s,72℃45 s,35個循環(huán);72℃10 min;16℃,保存。膠回收后的DNA,連接到pEASY-Blunt Cloning Kit(全式金,北京),并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α(全式金,北京)。挑選陽性克隆,送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(青島)進(jìn)行測序。

        利用ExPASy-ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)和ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分別分析TaERF8-2D蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性。使用SignalP 5.0在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測。采用TMHMM 2.0在線軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測TaERF8-2D蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。通過NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線預(yù)測分析蛋白的磷酸化位點。使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

        1.3 亞細(xì)胞定位分析

        設(shè)計帶有XbaⅠ和SalⅠ酶切位點的特異性引物 (F:5′-GCTCTAGAATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′;R:5′-ACGCGTCGACCGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′),擴(kuò)增無終止密碼子的TaERF8-2D全長CDS片段,經(jīng)雙酶切后,連接到表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α,然后篩選陽性克隆。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,鑒定陽性克隆并保存。將重組質(zhì)粒和對照空載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,室溫培養(yǎng)過夜,在激光共聚焦顯微鏡下,觀察原生質(zhì)體中綠色熒光的分布情況。

        1.4 鹽脅迫下的基因表達(dá)分析

        將室溫22℃、光照培養(yǎng)10 d的德抗961小麥幼苗置于250 mmol/L NaCl溶液中進(jìn)行脅迫處理,分別在處理0、3、6、12、24 h和48 h時取第一片展開葉片,液氮速凍后,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        按照植物組織RNA快速提取試劑盒(天根生化,北京)提取小麥葉片總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金,北京)合成cDNA第一鏈。利用TaERF8-2D基因的特異引物[21](F:5′-CGACAGATTGCAGCAACAACAACAGTG-3′;R:5′-CCCGTTGTGCCTGAGCTCGATATA-3′)和Tubulin內(nèi)參引物(F:5′-TCGATGA TCTCCAACTCCACCAGT-3′;R:5′-TCGTCGAACTCAGCACCAACTTCT-3′)進(jìn)行RT-PCR。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,檢測PCR產(chǎn)物。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 小麥TaERF8-2D基因的克隆

        以耐鹽小麥德抗961的cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測,在750 bp左右出現(xiàn)一個特異DNA條帶(圖1)。通過對其回收和測序,發(fā)現(xiàn)該片段長度為762 bp,編碼253個氨基酸。

        2.2 生物信息學(xué)分析

        2.2.1 TaERF8-2D編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析利用SOPMA網(wǎng)站對該基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,該編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲比例最高,占68.39%,α-螺旋占19.76%,延伸鏈占8.30%,β-轉(zhuǎn)角占3.56%(圖2)。

        2.2.2 蛋白理化性質(zhì)分析 通過ExPASy-Prot-Param分 析,TaERF8-2D蛋 白 的 分 子 式 為C1176H1845N353O365S6,分子量為26.96 kD,理論等電點(pI)為9.55,不穩(wěn)定系數(shù)為57.39,推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。對該蛋白的親水性、疏水性進(jìn)行分析表明,其總平均吸水性為-0.521,屬于親水蛋白(圖3)。

        2.2.3 蛋白信號肽預(yù)測 利用SignalP 5.0和TMHMM 2.0在線預(yù)測表明,該蛋白既無信號肽,也不存在跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4),由此推斷該蛋白不是分泌蛋白。

        圖2 TaERF8-2D蛋白的二級結(jié)構(gòu)

        圖3 TaERF8-2D蛋白的親水性和疏水性預(yù)測

        圖4 TaERF8-2D信號肽(A)及跨膜結(jié)構(gòu)域(B)分析

        2.2.4 氨基酸磷酸化修飾位點分析 使用在線軟件NetPhos 3.1對TaERF8-2D蛋白的磷酸化位點進(jìn)行分析,結(jié)果表明,該蛋白共有30個氨基酸磷酸化位點,其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點最多,有16個;其次為蘇氨酸(Thr),磷酸化位點有13個;而酪氨酸(Tyr)磷酸化位點僅有1個(圖5)。

        圖5 TaERF8-2D蛋白的氨基酸磷酸化位點分析

        2.3 亞細(xì)胞定位

        將含有重組載體pCAMBIA2300-35S::TaERF8-2D-GFP和對照空載體pCAMBIA2300-35SGFP的菌液,利用瞬時轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入擬南芥原生質(zhì)體,25℃暗培養(yǎng)24 h后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。結(jié)果顯示,TaERF8-2D::GFP融合蛋白僅在細(xì)胞核有明顯的綠色熒光,而對照空載體在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到綠色熒光信號,由此表明,編碼的TaERF8-2D蛋白定位于細(xì)胞核(圖6)。這與報道的ERF類轉(zhuǎn)錄因子主要定位于細(xì)胞核的結(jié)論相一致[22,23],主要參與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。

        圖6 TaERF8-2D蛋白的亞細(xì)胞定位

        2.4 鹽脅迫下TaERF8-2D基因的表達(dá)分析

        利用RT-PCR檢測TaERF8-2D基因?qū)}脅迫的響應(yīng)特性。結(jié)果顯示,在鹽脅迫24 h和48 h時,該基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)(圖7),進(jìn)一步證明TaERF8-2D基因可能與小麥鹽脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)。

        圖7 TaERF8-2D基因響應(yīng)鹽脅迫的RT-PCR分析

        3 討論與結(jié)論

        ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,廣泛參與植物發(fā)育、代謝和抗逆過程[5,10-14],是改良植物遺傳特性的優(yōu)異基因資源。ERF類轉(zhuǎn)錄因子主要參與逆境脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育,在眾多的ERF類轉(zhuǎn)錄因子成員中,僅有少數(shù)幾個ERF基因從普通小麥中被克隆出來[16,18-21,24]。本研究利用本團(tuán)隊獲得的耐鹽小麥轉(zhuǎn)錄組及其基因表達(dá)數(shù)據(jù),從耐鹽小麥品種中篩選到對鹽脅迫響應(yīng)非常明顯的基因TaERF8-2D。而有關(guān)TaERF8-2D基因編碼的蛋白信息以及該基因?qū)π←滬}脅迫的響應(yīng)尚未見報道,因此明確該基因編碼蛋白質(zhì)的特性、亞細(xì)胞定位以及鹽脅迫下的基因表達(dá)模式,對于進(jìn)一步探究該基因的耐鹽功能具有重要意義。

        蛋白質(zhì)的理化特性、亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明,小麥TaERF8-2D基因編碼的蛋白質(zhì)屬于親水蛋白,沒有信號肽且不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,不屬于分泌蛋白,該蛋白定位于細(xì)胞核,這與大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的定位信息相一致[22]。蛋白質(zhì)磷酸化作為一種重要的翻譯后修飾,是調(diào)控蛋白質(zhì)活力和功能的重要機(jī)制,廣泛參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆脅迫等多種生物過程[25]。本研究表明,TaERF8-2D蛋白共有30個氨基酸磷酸化位點,推測TaERF8-2D基因可能經(jīng)過蛋白磷酸化修飾后,行使其響應(yīng)鹽脅迫等逆境脅迫的生物學(xué)功能。

        前人研究表明,ERF類轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物鹽脅迫方面扮演重要角色。本研究RT-PCR結(jié)果表明,鹽脅迫處理后,TaERF8-2D表達(dá)被顯著誘導(dǎo),這與OsERF103、GmERF3、TaERF1、TaERF3等ERF類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)趨勢相似[14,16,19,26],暗示TaERF8-2D基因在小麥鹽脅迫響應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要作用,但其具體調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

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