易 幸

（湘潭市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測管理站，湖南 湘潭 411100）

蓮子屬睡蓮科，是水生草本植物蓮的種子[1-2]。湖南湘潭縣的湘蓮、浙江武義縣的宣蓮、福建建寧縣的建蓮和江西廣昌縣的贛蓮為我國四大蓮子，均為中國國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。蓮子是藥食同源的中藥，具有健脾止瀉、益腎固精、養(yǎng)心安神[3]、補(bǔ)中益氣[4]、清熱解毒等功效[2]，是老少皆宜的滋補(bǔ)保健佳品[5]。隨著蓮種植的快速規(guī)模化發(fā)展，蓮藕腐敗病、蓮葉枯病、蓮葉斑病等蓮病蟲害現(xiàn)象也愈來愈嚴(yán)重[6]，噴灑農(nóng)藥已逐漸成為當(dāng)前防治蓮病蟲草害的主要手段[7]。我國強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763—2019[8]中新增了多菌靈、吡蟲啉、嘧菌酯、吡蚜酮、啶蟲脒、丙環(huán)唑6種藥劑在蓮子（鮮）中的最大殘留限量值。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)對蓮子的相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分分析及其作用方面，而農(nóng)藥殘留檢測的文獻(xiàn)報道不多。如Miao等[9]建立了QuEChERS提取和氣相色譜-電子捕獲檢測器（GC-ECD）同時測定蓮子中36種有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法；張新忠等[7]建立了石墨化碳SPE柱凈化，UPLC-MS/MS法同時測定蓮子中12種農(nóng)藥殘留的方法。筆者擬用QuEChERS提取及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，研究新鮮蓮子中吡蚜酮、甲胺磷、多菌靈、滅多威等15 種農(nóng)藥殘留的測定方法。該方法可檢測有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、苯并咪唑類、煙堿類、甲氧基丙烯酸酯類、吡唑類、吡啶類等多類農(nóng)藥殘留，且操作簡單、步驟少、耗時短，無需經(jīng)SPE柱凈化，準(zhǔn)確度及精密度都比較理想，適宜于蓮子（鮮）多農(nóng)殘的測定和分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的新鮮蓮子采自湘潭縣湘蓮種植基地。

主要試劑有乙腈（色譜純，美國賽默飛），甲醇（色譜純，德國默克），甲酸（色譜純，天津光復(fù)），乙酸（色譜純，美國天地），乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）凈化劑、十八烷基鍵合相硅膠（C18）凈化劑（天津博納艾杰爾），無水硫酸鎂（優(yōu)級純，西亞試劑），氯化鈉（分析純，國藥試劑）。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品包括吡蚜酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、多菌靈、滅多威、吡蟲啉、啶蟲脒、涕滅威、克百威、嘧菌酯、氟蟲腈、倍硫磷、甲拌磷、辛硫磷，均從農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津）購買，以上15種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度均為1 000 μg/mL。試驗用水均為超純水。

主要儀器與設(shè)備有TSQ Quantum Acess超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源，美國賽默飛公司），電子天平（0.01 g和0.001 g，梅特勒-托利多有限公司），食品加工機(jī)（飛利浦），F(xiàn)A25高速分散勻漿機(jī)（德國弗魯克公司），H1850高速離心機(jī)（湖南湘儀有限公司），Vortex-2渦旋混勻儀（上海滬析實業(yè)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 （1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液配置：分別從濃度為1 000 μg/mL的15種標(biāo)準(zhǔn)溶液中，準(zhǔn)確吸取0.4 mL至 10.00 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制為40 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃以下儲存。（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液配置：分別用甲醇和空白樣品基質(zhì)液配制濃度為5、10、50、100、500 μg/L的15種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作標(biāo)和基質(zhì)標(biāo)。

1.2.2 樣品制備 剝?nèi)ド徸油鈿ぃ浞只靹?，?jīng)縮分后，放入食品加工機(jī)內(nèi)打碎，制成待檢樣，置于-18℃以下，備用。

1.2.3 樣品前處理流程 試驗采用QuEChERS法對樣品進(jìn)行提取凈化，其操作流程如下：準(zhǔn)確地稱取20.0 g 制備好的新鮮蓮子樣品于100 mL 離心管內(nèi)，用量筒量取40.0 mL提取溶劑加入離心管中，高速勻漿1 min，加入4 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，4 000 r/min離心3 min，移取2.0 mL上清液至5 mL離心管中，加入一定量的凈化劑進(jìn)行吸附凈化，渦旋1 min，12 500 r/min離心3 min，吸取1.0 mL上清液于已加入1.0 mL水的5 mL離心管內(nèi)，混合均勻后，過0.22 μm尼龍微孔濾膜至2 mL進(jìn)樣瓶中，待UPLC-MS/MS上機(jī)測定。

1.2.4 樣品前處理優(yōu)化 （1）提取溶劑的選擇：首先比較了丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷對15種農(nóng)藥的提取效果，然后進(jìn)一步對乙腈與含0.1%乙酸的乙腈的提取效果進(jìn)行了比較。（2）凈化劑及其用量的確定：常用的凈化劑有PSA、GCB、C18、無水硫酸鎂等，其中PSA凈化劑主要是去除各種有機(jī)酸、色素、糖、脂肪酸等[10]，GCB適合去除基質(zhì)中的色素、甾醇類等雜質(zhì)，C18用來去除維生素、色素、甾醇效果較好，無水硫酸鎂主要是去除水分?？紤]到蓮子的成分，研究考察了PSA、C18及無水硫酸鎂作為凈化劑對蓮子樣品中藥劑添加回收率和基質(zhì)溶液顏色的影響，并對其用量進(jìn)行了探討，詳見表1。

表1 QuEChERS法中不同凈化劑的比例

1.2.5 液相色譜條件優(yōu)化 （1）色譜柱：比較了Waters XBridge BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）和Thermo ACQUITY C18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）2種色譜柱的分離效果。（2）流動相：先比較了水-甲醇體系與0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作為流動相時目標(biāo)農(nóng)藥的色譜峰形及分離效果，再進(jìn)一步比較了0.1%甲酸水溶液-乙腈與0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時對目標(biāo)農(nóng)藥色譜峰峰形及響應(yīng)值的影響。（3）洗脫方式：考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作為流動相不同比例等度洗脫和梯度洗脫時，目標(biāo)農(nóng)藥的分離效果、靈敏度、重復(fù)性和保留時間等的影響。

1.2.6 質(zhì)譜條件優(yōu)化 將一定濃度的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過蠕動泵直接進(jìn)入質(zhì)譜儀中，在ESI正離子或負(fù)離子模式化合物經(jīng)過電噴霧離子源形成穩(wěn)定離子，通過全掃描MS模式準(zhǔn)確確定母離子，優(yōu)化錐孔電壓，使母離子的豐度達(dá)到最大。再用子離子掃描MS/MS 模式，選擇相對豐度較高、出峰穩(wěn)定的碎片離子作為子離子。最后在選擇反應(yīng)監(jiān)測SRM模式下，進(jìn)一步優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，使子離子的豐度最高，從而得到質(zhì)譜參數(shù)[11]。

1.2.7 基質(zhì)效應(yīng)弱化 （1）基質(zhì)效應(yīng)基本定義及計算方法?；|(zhì)效應(yīng)是指待測物中除目標(biāo)物外的其他物質(zhì)對其測定結(jié)果的本質(zhì)影響[12-13]。在質(zhì)譜分析中，基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的主要原因是在離子化過程中，基質(zhì)各組分與目標(biāo)物之間相互競爭，分為基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)[14]?；|(zhì)效應(yīng)通常用相對響應(yīng)值法進(jìn)行評估，公式為ME（%）=（A/B）×100，其中，ME是基質(zhì)效應(yīng)，A是基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的響應(yīng)平均值，B為甲醇溶劑的同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的響應(yīng)平均值。（2）基質(zhì)效應(yīng)評價。當(dāng)ME為80%～120%時，為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME為50%～80%或120%～150%時，為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME≤50%或≤150%時，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[15]。當(dāng)ME＜100%為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME＞100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。常用的消除或減弱基質(zhì)效應(yīng)的方法為基質(zhì)匹配標(biāo)樣校正法、內(nèi)標(biāo)法、稀釋法和統(tǒng)計學(xué)校正法等[13]。該研究采用空白基質(zhì)提取液匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行弱化，通過外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.2.8 方法驗證 將空白樣品基質(zhì)提取液配制的各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測，以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察15種農(nóng)藥的濃度與峰面積的線性關(guān)系和定量限。在空白蓮子樣品中添加不同濃度目標(biāo)物進(jìn)行添加回收率試驗，相同添加濃度進(jìn)行7 次重復(fù)測試，以驗證方法的回收率及精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取最佳條件

2.1.1 最佳提取溶劑 常用的提取溶劑有丙酮、乙腈、乙酸乙酯、正己烷，極性強(qiáng)弱順序為乙腈＞丙酮＞乙酸乙酯＞正己烷。試驗結(jié)果顯示，在0.1 mg/kg的農(nóng)藥添加濃度水平時，乙腈提取效果較理想，丙酮提取效果次之，乙酸乙酯和正己烷的提取效果最差。這可能是因為乙酸乙酯和正己烷的極性較弱，而有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的極性較大，根據(jù)相似相溶原理，乙酸乙酯和正己烷的提取效果不理想；丙酮的極性較強(qiáng)，雖能溶解大部分農(nóng)藥，卻也能溶解植物組織中的油脂和色素，不利于接下來的凈化；乙腈的極性較強(qiáng)，對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類等強(qiáng)極性農(nóng)藥的溶解性更好，加上乙腈對油脂、色素等雜質(zhì)的溶解少，同時還可有效減少淀粉和蛋白質(zhì)向提取液遷移。故選擇乙腈進(jìn)行后續(xù)試驗。進(jìn)一步對乙腈與含0.1%乙酸的乙腈的提取效果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，這2種提取溶劑對大多數(shù)目標(biāo)農(nóng)藥的提取效果差不多，但甲胺磷、氧樂果等目標(biāo)農(nóng)藥在添加了0.1%乙酸的乙腈中提取效率有所提高，可能是乙腈中加入少量乙酸后，溶液為弱酸體系，有利于保持大部分農(nóng)藥的穩(wěn)定性，因為有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是酯類結(jié)構(gòu)，堿性環(huán)境促使其加速水解，相反在弱酸環(huán)境下則水解得較慢，故蓮子樣品的最終提取溶劑確定為含0.1%乙酸的乙腈溶液。

2.1.2 最佳凈化劑及用量 試驗結(jié)果顯示，在添加了0.1 mg/kg農(nóng)藥的蓮子樣品中，不同用量的PSA、C18、無水硫酸鎂對提取液的顏色影響不大，可能是因為蓮子的提取液本身顏色較淺。由表1可知，當(dāng)無水硫酸鎂的用量從0.100 g/mL增加至0.150 g/mL時，目標(biāo)物的回收率相差不大，可能是蓮子樣品的含水量本身較低。當(dāng)PSA的用量從0增加至0.025 g/mL時，回收率明顯提高；但當(dāng)PSA的用量從0.025 g/mL增加至0.050 g/mL時，部分目標(biāo)農(nóng)藥的回收率略有下降。當(dāng)添加PSA用量不變，C18的用量從0增加至0.025 g/mL時，回收率變化不明顯，而C18的用量從0.025 g/mL增加至0.050 g/mL時，部分目標(biāo)農(nóng)藥的回收率略有下降。這表明過量使用PSA、C18和無水硫酸鎂，會吸附目標(biāo)物，導(dǎo)致目標(biāo)物回收率偏低。而適量的PSA不僅能有效去除蓮子中的色素和糖類，還能達(dá)到較高的回收率，同時在添加了PSA的條件下，適量C18對湘蓮回收率及凈化效果并無多大影響，且因湘蓮本身含水量低，減少無水硫酸鎂的用量不會對回收率產(chǎn)生影響，同時還可避免因過多的無水硫酸鎂放熱，導(dǎo)致溫度升高過快，影響遇熱易分解農(nóng)藥的提取效果[16]。綜合考慮，最終選擇以0.025 g/mL PSA+0.100 g/mL 無水硫酸鎂混合物作為凈化劑，添加回收率達(dá)到86.8%～108.8%。

2.2 色譜條件參數(shù)

2.2.1 色譜柱 試驗結(jié)果表明，在同一色譜和質(zhì)譜條件下，15種目標(biāo)物在色譜柱Waters XBridge BEH C18上，保留性能更好，保留時間和色譜峰型都較理想。

2.2.2 流動相 試驗結(jié)果顯示，0.1%甲酸水-甲醇體系色譜峰響應(yīng)更強(qiáng)，峰形更好，靈敏度更高，因為加入甲酸后，更好地提高了目標(biāo)農(nóng)藥的離子化效率。進(jìn)一步比較0.1%甲酸水溶液-乙腈與0.1%甲酸水溶液-甲醇2種流動相對目標(biāo)農(nóng)藥色譜峰峰形及響應(yīng)值的影響，結(jié)果顯示，目標(biāo)物色譜峰的保留時間、響應(yīng)值等都受流動相影響。這2種體系作流動相時，目標(biāo)農(nóng)藥的峰形均較尖銳，且能很好地分離，然而采用0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作流動相時，目標(biāo)物保留時間比0.1%甲酸水溶液-甲醇作流動相時要短些，但大多數(shù)目標(biāo)物峰的響應(yīng)值卻比0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作流動相時低至少一倍以上，原因可能是在甲醇體系中，目標(biāo)物的離子化效率相對更高。綜合考慮到目標(biāo)物的色譜峰形、保留時間、響應(yīng)值、分離度、靈敏度和信噪比等因素，選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇體系作為流動相，目標(biāo)農(nóng)藥的色譜峰形和分離效果均較理想，響應(yīng)值更高。

2.2.3 洗脫方式 試驗結(jié)果顯示，采用等度洗脫方式時，目標(biāo)物的分離效果、靈敏度、重復(fù)性和保留時間均不理想；而進(jìn)行梯度洗脫時，目標(biāo)農(nóng)藥色譜峰的保留時間短，峰寬變窄，峰形尖銳，靈敏度高。

因此，綜合考慮最終確定色譜柱為Waters XBridge BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），柱溫40℃；以0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2，流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件參數(shù)

優(yōu)化后，質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（ESI）；正、負(fù)離子掃描模式；噴霧電壓（+）3.5 kV、（-）2.5 kV；離子傳輸管溫度350℃；離子源溫度300℃；鞘氣壓力0.20 MPa；輔助氣壓力0.069 MPa；碰撞氣為Ar氣，壓力0.199 5 Pa。采用選擇反應(yīng)監(jiān)測掃描（SRM），以目標(biāo)化合物的保留時間和離子對信息進(jìn)行定性分析，以其定量離子峰面積進(jìn)行定量分析，15種農(nóng)藥的具體質(zhì)譜參數(shù)見表3。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由表4可知，優(yōu)化后，吡蚜酮存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，甲胺磷、氧樂果、多菌靈、甲拌磷4種農(nóng)藥存在中等基質(zhì)抑制效應(yīng)，其余農(nóng)藥存在弱基質(zhì)抑制效應(yīng)。

表3 SRM監(jiān)測模式下15種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法的線性方程、定量限、回收率及精密度

表4 15種農(nóng)藥在蓮子中的基質(zhì)效應(yīng) （%）

如表5所示，各目標(biāo)物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與其峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，方法的定量限為5.00～10.0 μg/kg；添加回收試驗結(jié)果顯示，在低、中、高3個添加水平下，平均添加回收率在82.5%～108.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.1%～8.6%之間，均滿足“GB/T 27417—2017合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南”以及農(nóng)業(yè)部2386號公告《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》的要求。15種農(nóng)藥的SRM色譜圖見圖1。

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用該研究優(yōu)化后的提取測定方法對采自湘潭縣蓮子生產(chǎn)基地的20份湘蓮樣品進(jìn)行15 種農(nóng)藥殘留的檢測，檢測結(jié)果為15種農(nóng)藥均未檢出。

3 結(jié) 論

應(yīng)用QuEChERS提取及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了新鮮蓮子中吡蚜酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧樂果、多菌靈、滅多威、吡蟲啉、啶蟲脒、涕滅威、克百威、嘧菌酯、氟蟲腈、甲拌磷、倍硫磷、辛硫磷15種農(nóng)藥殘留的檢測分析方法，涉及有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、苯并咪唑類、煙堿類、甲氧基丙烯酸酯類、吡唑類、吡啶類等多種農(nóng)藥類型。

表5 目標(biāo)化合物的線性回歸方程、添加回收率和精密度結(jié)果

試驗結(jié)果表明：新鮮蓮子樣品用含0.1%乙酸的乙腈提取，用0.025 g/mL PSA+0.100 g/mL無水硫酸鎂混合物凈化，回收率和凈化效果最優(yōu)；采用優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件對樣品中吡蚜酮、甲胺磷、乙酰甲胺磷等15種農(nóng)藥進(jìn)行檢測，在5～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，15種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與其峰面積的線性關(guān)系良好，線性回歸系數(shù)（R2）均大于0.99，方法的定量限為5.00～10.0 μg/kg；在低、中、高3個添加水平下，平均添加回收率在82.5%～108.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.1%～8.6%之間。該方法前處理操作簡單，步驟少，耗時短，無需經(jīng)SPE柱等凈化，且準(zhǔn)確度及精密度都比較理想，能滿足對新鮮蓮子中15種農(nóng)藥殘留的定性定量分析要求，適宜于蓮子（鮮）農(nóng)藥殘留的測定和分析。

應(yīng)用該研究優(yōu)化后的提取測定方法對采自湘潭縣蓮子生產(chǎn)基地的20份湘蓮樣品進(jìn)行15 種農(nóng)藥殘留的檢測，檢測結(jié)果為15種農(nóng)藥均未檢出，表明該基地所產(chǎn)蓮子的農(nóng)藥殘留量均符合“藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)”和“GB2763—2019食品中農(nóng)藥最大殘留限量”的相關(guān)要求。

圖1 15種農(nóng)藥的SRM色譜圖