嚴(yán)金昌， 肖英平， 王遠(yuǎn)霞， 呂文濤， 李景上， 楊 華， 劉秀婷*

（1．嘉興市秀洲區(qū)王店鎮(zhèn)政務(wù)服務(wù)中心，浙江嘉興314011；2.省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子

與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021）

隨著我國(guó)集約化、規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)上通常對(duì)仔豬實(shí)施早期斷奶，但由于早期斷奶仔豬的消化道發(fā)育尚未完善，消化液及相關(guān)酶分泌不足，胃腸道的微生態(tài)區(qū)系不穩(wěn)定且腸道的免疫功能低下，同時(shí)斷奶過(guò)程中仔豬還需要經(jīng)受環(huán)境、心理、營(yíng)養(yǎng)等一系列的應(yīng)激，因此早期斷奶會(huì)給仔豬的正常生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)一系列的影響，如厭食、生長(zhǎng)遲滯、消化機(jī)能紊亂、腹瀉水腫、飼料利用率低等不良現(xiàn)象，稱為“仔豬早期斷奶綜合征”，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益（寇莎莎等，2018；Wijtten等，2011）。早期斷奶的仔豬采食量降低，需要消耗體內(nèi)的脂肪以供機(jī)體的代謝需要（李國(guó)俊和崔榮飛，2018）。

參與肝臟脂類代謝的關(guān)鍵酶包括ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）、乙酰CoA羧化酶（ACC）和脂肪酸合成酶（FAS）。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）也是啟動(dòng)脂肪動(dòng)員的關(guān)鍵脂肪酶，其能特異性地水解甘油三酯（TG）的第一酯鍵，是TG水解過(guò)程的限速酶（Luca等，2019；Zimmerman等，2004）。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控脂類代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，主要通過(guò)促進(jìn)脂肪和膽固醇合成中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂質(zhì)新生（吳鐵梅等，2016）。

早期斷奶仔豬的機(jī)體代謝狀況必然發(fā)生變化，然而仔豬機(jī)體的脂類物質(zhì)含量變化及肝臟和脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平變化仍然未知。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)研究早期斷奶對(duì)仔豬機(jī)體脂類物質(zhì)含量和肝臟及脂肪組織中脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，探究影響早期斷奶仔豬代謝的關(guān)鍵因素，為早期斷奶仔豬的營(yíng)養(yǎng)代謝功能調(diào)控研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 選取4個(gè)窩的16頭18日齡仔豬，將來(lái)自于不同窩的4頭仔豬稱重，采血后直接用于屠宰取樣，作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；另外12頭進(jìn)行斷奶處理，為斷奶組，每4頭一起飼養(yǎng)在與母豬欄環(huán)境相同的小欄中，飼喂配合飼料。母豬正常哺乳窩中剩余的仔豬，為非斷奶組。在斷奶后第1、3、7天（分別對(duì)應(yīng)仔豬19、21、25日齡），從斷奶組和非斷奶組各取4頭仔豬稱重，采血后屠宰取樣。試驗(yàn)期間自由飲水和采食。哺乳母豬飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1（楊華等，2018）。仔豬飼料由浙江國(guó)茂飼料有限公司提供，參考美國(guó)NRC（1998）標(biāo)準(zhǔn)配制，具體組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表1 哺乳母豬飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集 于分組處理后0、1、3 d和7 d分別從斷奶組和非斷奶組選取4頭仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血，4℃下3000g離心10 min后得到血清樣本，然后屠宰取肝臟與背最長(zhǎng)肌樣本，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 斷奶仔豬飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）

1.3 血清脂類物質(zhì)含量的測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒分析血清中甘油三酯（TG）、膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）指標(biāo)，試驗(yàn)操作按照相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)分析 采用總RNA抽提試劑盒提取肝臟組織的總RNA，利用Nano Drop微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度，以O(shè)D260nm/OD280nm評(píng)價(jià)RNA的純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptTMⅡRTase反轉(zhuǎn)錄cDNA。

采用Premier 6.0和Beacon designer軟件進(jìn)行目的基因和18S rRNA內(nèi)參基因引物的設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表3。采用TaKaRa SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM進(jìn)行基因的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，具體 如 下：ddH2O 10.5μL，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，上、下游引物各1μL，cDNA模板1.0μL。反應(yīng)條件：95℃，1 min；45個(gè)循環(huán)：95℃，10 s；62℃，25 s；由55℃連續(xù)上升到95℃，每5 s溫度上升0.5℃，以制備熔點(diǎn)曲線。

表3 脂肪合成相關(guān)目的基因和18S rRNA內(nèi)標(biāo)基因引物參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理 肝臟基因表達(dá)數(shù)據(jù)根據(jù)系統(tǒng)自動(dòng)分析的ACL、FAS、ACC、ATGL和SREBP 1以及18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率得到PCR擴(kuò)增效率（E），E=10（-1/slope）。ACL、FAS、ACC、ATGL和SREBF 1的擴(kuò)增效率都接近100%，且相互間效率偏差在5%以內(nèi)，以目的基因mRNA的拷貝數(shù)與對(duì)應(yīng)樣品內(nèi)參基因mRNA的拷貝數(shù)的比值來(lái)表示基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平以2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)檢測(cè)得到的3個(gè)Ct值取算術(shù)平均值（楊華等，2018）。血清中脂類物質(zhì)的含量以及基因表達(dá)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 早期斷奶對(duì)仔豬血清脂類物質(zhì)含量的影響從圖1可看出，早期斷奶可顯著降低仔豬血清TG、總膽固醇、HDL和LDL含量，并表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，在斷奶后第3天開(kāi)始下降。

與非斷奶仔豬比較，仔豬在斷奶后的第3、7天，血清TG含量分別降低了26.51%（P＜0.05）和36.71%（P＜0.05）；膽固醇含量分別降低了26.18%（P＜0.05）和40.93%（P＜0.05）；HDL含量分別降低了29.69%（P＜0.05）和31.34%（P＜0.05）。斷奶仔豬血清LDL含量在斷奶后的第1、3、7天分別比非斷奶仔豬降低了24.05%（P＜0.05）、37.65%（P＜0.05）和23.17%（P＜0.05）。

圖1 早期斷奶仔豬和對(duì)應(yīng)同日齡哺乳仔豬血清TG、膽固醇、HDL和LDL含量

2.2 早期斷奶對(duì)仔豬肝臟脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖2可知，早期斷奶處理可提高仔豬肝臟中ACL基因的表達(dá)水平，但是肝臟中ACC、FAS和SREBP-1基因的表達(dá)水平降低，并表現(xiàn)為一致的變化趨勢(shì)。與非斷奶同日齡仔豬比較，在斷奶后第1、3、7天，斷奶仔豬肝臟ACL基因的mRNA表達(dá)水平分別提高了113.33%（P＜0.05）、106.15%（P＜0.05）和100.00%（P＜0.05），ACC表達(dá)水平分別降低了26.67%（P＜0.05）、53.51%（P＜0.05）和33.86%（P＜0.05），F(xiàn)AS表達(dá)水平分別降低了72.57%（P＜0.05）、85.71%（P＜0.05）和27.66%（P＜0.05），SREBP-1表達(dá)水平分別降低了58.72%（P＜0.05）、47.69%（P＜0.05）和11.69%（P＜0.05）。

2.3 早期斷奶對(duì)仔豬脂肪組織脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖3所示，早期斷奶使仔豬皮下脂肪組織中ATGL的表達(dá)水平升高，使FAS的表達(dá)水平降低。在斷奶后的第1、3、7天，脂肪組織中ATGL表達(dá)水平分別升高了51.02%（P＜0.05）、50.00%（P＜0.05）和26.50%（P＞0.05），F(xiàn)AS表達(dá)水平分別降低了73.33%（P＜0.05）、60.17%（P＜0.05）和37.10%（P＜0.05）。

3 討論

哺乳動(dòng)物多余的能量主要以甘油三酯（TG）的形式儲(chǔ)存在脂肪組織中，當(dāng)動(dòng)物處于饑餓或當(dāng)機(jī)體能量匱乏時(shí)，貯存的脂質(zhì)就會(huì)發(fā)生脂解，由TG分解成非酯化的脂肪酸，釋放進(jìn)入血液參與新陳代謝提供能量，脂肪的儲(chǔ)存及動(dòng)員處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)（Bell等，2005；Flier，2004）；沉積發(fā)生在仔豬初生后的各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段。Lodge等（1978）研究指出，初生時(shí)期仔豬的體脂肪含量?jī)H為1%～2%（脂肪型豬約為4%），隨著日齡增加脂肪沉積逐漸增多，1周齡時(shí)體脂量約7%，2周齡時(shí)為12%～15%，到4周齡時(shí)體脂量是初生時(shí)的90倍左右，但是體重僅為5倍多；16周齡后，雖然脂肪沉積量仍在增加，但其脂肪合成率開(kāi)始下降。

早期斷奶的仔豬因受到斷奶應(yīng)激的影響，會(huì)通過(guò)消耗機(jī)體的脂肪以滿足其代謝需要。ACC和FAS是體內(nèi)脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。ACC是長(zhǎng)鏈脂肪酸從頭合成的限速酶，催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，其活性的高低可影響肝臟及肌肉組織中的脂肪代謝（Sone等，2016）。FAS存在于脂肪、肝臟及肺等組織中。動(dòng)物的體脂沉積所需要的脂肪酸大多來(lái)自于脂肪酸的全程合成，即由FAS催化乙酰CoA和丙二酰CoA生成長(zhǎng)鏈脂肪酸，然后再合成甘油三脂（TG）（Simith等，2003）。FAS活性的高低直接控制著體內(nèi)脂肪合成的強(qiáng)弱，對(duì)控制動(dòng)物體脂的沉積具有重要的調(diào)控作用（Wang等，2004）。FAS表達(dá)水平升高能顯著增加TG在體內(nèi)的沉積，從而導(dǎo)致肥胖。脂肪組織中FAS與酮體脂肪量及脂肪率成極顯著正相關(guān)。通過(guò)抑制FAS的活性，可阻滯脂肪產(chǎn)生通路，減少脂肪合成，升高丙二酰CoA濃度，從而達(dá)到降低飲食的目的。

在仔豬早期斷奶階段，采食日糧由含乳糖、乳蛋白和乳脂等易于消化的液態(tài)乳汁轉(zhuǎn)變成以玉米-豆粕為主的固態(tài)日糧，日糧的轉(zhuǎn)變使其采食量急劇下降，能量攝入驟減，從而導(dǎo)致仔豬能量代謝處于負(fù)平衡狀態(tài)（Xiao等，2012）。Pié等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，仔豬在斷奶后的24 h內(nèi)僅采食到了11 g飼糧，在斷奶后2 d和8 d分別增加至214 g和384 g。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，早期斷奶仔豬血清中TG、膽固醇、HDL、LDL等脂類物質(zhì)含量均降低，同時(shí)肝臟ACC、FAS和SREBP-1基因表達(dá)水平顯著降低，脂肪組織中FAS基因表達(dá)水平也相應(yīng)地降低，表明早期斷奶使仔豬脂肪合成能量下降，仔豬早期斷奶階段為了維持機(jī)體的能量供給，動(dòng)員已儲(chǔ)存的脂肪，通過(guò)脂肪的脂解作用，保障機(jī)體能量代謝的平衡。ACL是糖代謝與脂肪酸合成代謝之間的橋梁，位于脂質(zhì)代謝通路的最上游，其活性受磷酸化和去磷酸化途徑的調(diào)節(jié)，磷酸化酶是ACL活性形式（Sun等，2010）。研究表明，在早期斷奶仔豬的肝臟中ACL基因表達(dá)量升高，這可能是由于機(jī)體糖類代謝的需要，提高了ACL基因的表達(dá)水平以參與機(jī)體的糖類代謝。

ATGL是一種啟動(dòng)脂肪細(xì)胞脂動(dòng)員的脂肪分解酶，能夠特異性地分解TG（Zimmermann等，2004）。豬、人和鼠的ATGL主要在脂肪組織中表達(dá)，是脂肪及其他組織中TG水解起始步驟的限速酶（Shan等，2008；Jenkins等，2004）。ATGL基因表達(dá)水平受到日糧、激素等因素的影響。當(dāng)動(dòng)物限飼或禁食時(shí)，ATGL將TG分解成游離脂肪酸（FFA）以供其他組織利用。Kershaw等（2006）研究指出，限飼可誘導(dǎo)鼠ATGL基因的表達(dá)。Villena等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，大鼠限飼12、24 h和48 h，脂肪組織中ATGL表達(dá)水平先升高后降低；重新補(bǔ)飼后，ATGL表達(dá)水平繼續(xù)下降。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在早期斷奶仔豬的脂肪組織中，ATGL表達(dá)水平顯著升高，與前人的研究結(jié)果（Kershaw等，2006）相一致。

4 結(jié)論

仔豬在早期斷奶過(guò)程中，血清中甘油三酯（TG）、膽固醇、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）含量降低。同時(shí)，肝臟脂類代謝的關(guān)鍵酶乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）基因表達(dá)水平均降低，皮下脂肪組織中FAS基因表達(dá)水平降低，甘油三酯脂肪酶（ATGL）的基因表達(dá)水平升高，反映了仔豬在早期斷奶階段通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟及脂肪組織的脂類代謝關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達(dá)水平動(dòng)員脂肪，從而為機(jī)體提供能量以保證供給平衡。