王思文,娜仁圖雅,籍學(xué)偉*

(1.呼和浩特市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010020)

蒙醫(yī)藥作為傳統(tǒng)醫(yī)藥重要組成部分，千百年來為守護(hù)蒙古族人民的身體健康作出了重要貢獻(xiàn)，蒙醫(yī)藥也以其獨(dú)特的療效越來越被大家所關(guān)注。 三子散[1]作為傳統(tǒng)蒙醫(yī)成方制劑便是其中之一，本方是由訶子、川楝子、梔子三味藥材制成，收載于《中國藥典》2015年版一部，具有清熱涼血和解毒的藥理作用，可用于溫?zé)帷⒀獰?、新久熱。訶子作為方中主要藥味，其性苦，酸，澀，平，歸肺、大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽、強(qiáng)身健體、增強(qiáng)脾胃消化等功效[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，訶子中化學(xué)成分較為豐富，主要包括酚酸類、鞣質(zhì)類、三萜類、黃酮類等[3]。本次試驗(yàn)采用高效液相色譜法以訶子中沒食子酸為指標(biāo)性成分建立了三子散含量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

島津LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PL-203梅特勒-托利多電子天平(千分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；Mettler AE-100型電子天平(萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius ME 5型電子天平(百萬分之一，賽多利斯儀器有限公司)。

三子散(烏蘭浩特中蒙制藥有限公司，批號(hào)190630；內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，批號(hào)2001043、2002029、1907055、1907056；內(nèi)蒙古庫倫蒙藥有限公司，批號(hào)191251、190706、180444)。

沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)110831-201906)，購自中國食品藥品檢定研究院；模擬樣品為自制；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(5∶95)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10μL；檢測(cè)波長：273nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含70μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取三子散約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理(功率300W ，頻率40kHz) 30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例及制備工藝制成不含訶子的陰性樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法制備缺訶子的陰性對(duì)照溶液，即得。

2.5 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，分別按“2.1色譜條件”進(jìn)樣并記錄色譜圖。供試品呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對(duì)照在相應(yīng)位置無色譜峰。色譜圖見圖1。

A.對(duì)照品 B.供試品 C.陰性對(duì)照品

2.6 線性關(guān)系的考察

取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度為0.7mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL置10mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明：沒食子酸在6.357μg～158.935μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=31624x+14985，R=0.999。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品(批號(hào)2001043)并于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、24h測(cè)定含量以考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得沒食子酸峰面積的RSD為0.15%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào)2001043)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定沒食子酸峰面積積分值。結(jié)果沒食子酸峰面積的RSD為0.45%。表明儀器精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品(批號(hào)2001043)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖并計(jì)算沒食子酸的含量。沒食子酸的平均含量為3.14mg/g，RSD為1.18%。表明方法的重復(fù)性好。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的供試品(批號(hào)2001043)6份，每份約0.25g，精密稱定，分別置6個(gè)具塞錐形瓶中。精密加入濃度為80.2μg/mL的沒食子酸對(duì)照品溶液10mL(相當(dāng)于供試品含有量的100%)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果沒食子酸的平均加樣回收率(n=6)為97.70%，RSD為1.30%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.11 供試品測(cè)定

取8批樣品，各約0.5g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算沒食子酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 供試品含量測(cè)定結(jié)果

本次研究按照擬定的方法對(duì)三家生產(chǎn)企業(yè)共8批次樣品進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果顯示，不同廠家產(chǎn)品的沒食子酸含量之間有差異。此外，同一家生產(chǎn)企業(yè)同一年度內(nèi)生產(chǎn)的樣品，其含量測(cè)定結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定；不同年度生產(chǎn)的樣品，測(cè)定結(jié)果存在一定的差異。分析原因可能是不同生產(chǎn)企業(yè)使用了不同來源的訶子藥材使得含量有所差異，具體原因有待進(jìn)一步考察研究。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

參照標(biāo)準(zhǔn)“那如三味丸”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[5]，以甲醇-0.1%磷酸溶液(2∶98)為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則“高效液相色譜法”項(xiàng)下規(guī)定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時(shí)，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑一般不低于5%，否則易導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定[6]。在測(cè)定過程中，考察了流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液比例(8∶92)和(5∶95)，結(jié)果表明以甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95)作流動(dòng)相時(shí)色譜分離效果更好[7-10]。因此，選擇了甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95)為流動(dòng)相。

3.2 提取溶劑及方法的選擇

試驗(yàn)分別采用50%甲醇、75%甲醇、甲醇作為提取溶劑，考察提取效果，結(jié)果表明，用50%甲醇提取的效果最佳；試驗(yàn)對(duì)回流提取、超聲提取和振搖提取進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，回流提取與超聲提取效率高且相似?？紤]到方法的簡(jiǎn)便易行，確定采用超聲提取方法[11-15]。通過對(duì)不同提取時(shí)間的考察發(fā)現(xiàn)，超聲處理30min后，沒食子酸的含量基本不再增加，故確定超聲時(shí)間為30min。

3.3 總結(jié)

本文采用高效液相色譜法建立了測(cè)定三子散中沒食子酸的含量測(cè)定方法，該法操作簡(jiǎn)便，過程容易控制，重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率結(jié)果均較佳，陰性對(duì)照無干擾，可作為進(jìn)一步提高三子散質(zhì)量的方法。