梁國棟，陳美玲，張 婷，劉衛(wèi)東*

(1. 內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2. 湖南省藥物安全評價研究中心，湖南 長沙 410331；3. 內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

皮膚病是人類最常見的疾病之一，根據(jù)目前報告，已有近2000個病種，臨床表現(xiàn)多種多樣。除了系統(tǒng)性治療外，外用藥物是皮膚病治療的主要方法。臨床上對于外用藥物的治療原則主要有選擇合理劑型，注意年齡、性別和部位，以及重視不良反應(yīng)[1]。因此，對于外用藥的研究要注重療效的同時也要避免不必要的不良反應(yīng)。

復(fù)方醋酸氟輕松酊曾用名是皮炎寧酊，是腎上腺皮質(zhì)激素類藥。適用于神經(jīng)性皮炎，對銀屑病也有一定療效，因其價格低廉，使用方便，作為外用制劑在臨床上應(yīng)用廣泛[2]。復(fù)方醋酸氟輕松酊是由醋酸氟輕松、水楊酸、冰片、甘油、二甲基亞砜、乙醇和適量的水組成。其中醋酸氟輕松具有較強(qiáng)的抗炎抗過敏作用，可緩解紅腫熱痛癥狀[3]，冰片局部擦用后有止痛、抗菌作用，間苯二酚能殺滅細(xì)菌和真菌，同時也有止癢和溶解角質(zhì)的作用[4]。姜文霞等[5]提出，醋酸氟輕松在酸、堿、高溫條件下易降解成游離醋酸氟輕松降解產(chǎn)物，影響復(fù)方醋酸氟輕松酊在皮膚的滯留和吸收，對治療效果造成影響或增加全身暴露的不良反應(yīng)的風(fēng)險。通過我們前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)調(diào)整皮酊的工藝，可以減少雜質(zhì)的產(chǎn)生。為了更好的探究模擬實(shí)際情況，需要開展體外透皮實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。采用Franz擴(kuò)散池，選取與人體皮膚穿透性特征最近的巴馬小型豬皮為模型[6-7]，測定復(fù)方醋酸氟輕松酊中間苯二酚、水楊酸、醋酸氟輕松及醋酸氟輕松降解產(chǎn)物的累積透過量、皮膚剩余量和皮膚滯留量，探究不同工藝條件受試酊劑透皮行為的一致性，并考察含有不同濃度醋酸氟輕松的受試酊劑透皮行為的差異性，為產(chǎn)品的安全性和有效性評價提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

TK-24BL型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鎧凱科技貿(mào)易有限公司)，LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津有限公司)，AUW220D型分析天平(日本島津有限公司)，Legend TM MACH 1.6/R型臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo)，Sigma 1-14 離心機(jī)(德國 Sigma)，KQ-300E超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)。

受試酊劑工藝1(批號：1701122201)，受試酊劑工藝2(批號：1801090302)，受試酊劑工藝3(同受試酊劑工藝2處方中加入12%的醋酸氟輕松降解物,批號：1801090303)，三種受試酊劑處方執(zhí)行國家處方標(biāo)準(zhǔn)(國藥準(zhǔn)字H15021088)。

醋酸氟輕松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國食品藥品檢定研究院，批號：100010-201108，純度100.0%)，醋酸氟輕松降解物對照品(自制，純度99.9%)，間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國食品藥品檢定研究院，批號：100389-201202，純度99.9%)，水楊酸原料藥(中國食品藥品檢定研究院，批號：100106-201605，純度99.7%)，甲醇(TEDIA，批號：15055025，色譜純)，乙腈(SIGMA，批號：WXBC1009V，色譜純)，甲酸(德國CNW，批號：L401K140，色譜純)，磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20150801，色譜純)，無水乙醇(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20161025，分析純)。

巴馬小型豬離體皮膚，泰州泰和生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證編號：SYXK(湘)2015-0016。

2 方法與結(jié)果

2.1 離體豬皮膚經(jīng)皮滲透試驗(yàn)

利用Franz擴(kuò)散池，將豬皮固定在供給池與接收池之間，角質(zhì)層面向供給池一側(cè)，供給池中加入復(fù)方醋酸氟輕松酊劑0.1mL，接收池中加入8mL的接收液(含5%乙醇的生理鹽水)，接收池底部凹槽中放入磁力攪拌子，攪拌速度200rpm，溫度37℃±0.2℃，于2、3、4、6、8h定時取樣，每次吸取0.9mL接收液，隨即補(bǔ)加等體積同溫度的接收液，8h后終止試驗(yàn)。三批次(批號1701122201、1801090302、1801090303)復(fù)方醋酸氟輕松酊分別平行操作6份。利用HPLC測定接收液樣品醋酸氟輕松、醋酸氟輕松降解產(chǎn)物、間苯二酚、水楊酸的濃度。

2.1.1含量測定的色譜條件

醋酸氟輕松降解物、間苯二酚、水楊酸的色譜條件。色譜柱：Venusil ASB C18(50×4.6mm，5μm)；保護(hù)柱：phenomenex C18(4.0×3.0 mm，5μm)；流動相：A相：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇—乙腈溶液(5：1，v/v)；按表1進(jìn)行梯度洗脫：流速：0.7mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。檢測波長：240(間苯二酚)、270nm(水楊酸、醋酸氟輕松降解物、醋酸氟輕松)。

表1 醋酸氟輕松降解物、間苯二酚和水楊酸接收液的梯度洗脫程序

醋酸氟輕松的色譜條件。色譜柱：Venusil ASB C18(50×4.6mm，5μm)；保護(hù)柱：phenomenexC18(4.0×3.0mm，5μm)；流動相：A相：0.1%磷酸水溶液：B相：甲醇乙腈溶液(5∶1，v/v)=35∶65；流速：0.85mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：240nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2溶液的配制

儲備液的制備：精密稱取醋酸氟輕松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)8.00mg，置于10.0mL棕色容量瓶，加甲醇適量，使其溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為800mg/L的醋酸氟輕松儲備溶液，2℃～10℃保存；精密稱取醋酸氟輕松降解物對照品8.00mg，置于10.0mL棕色容量瓶，加甲醇適量，使其溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為800mg/L的醋酸氟輕松降解產(chǎn)物儲備溶液，2℃～10℃保存；精密稱取水楊酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)40.00mg，置于5.0mL棕色容量瓶，加甲醇適量，使其溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為8000mg/L的水楊酸儲備溶液，2℃～10℃保存；精密稱取間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)40.00mg，置于5.0mL棕色容量瓶，加甲醇適量，使其溶解后定容至刻度，搖勻，即得濃度為8000mg/L的間苯二酚儲備溶液，2℃～10℃保存。

空白接收液的制備：將豬皮固定在供給池與接收池之間，角質(zhì)層面向供給池一側(cè)，供給池中加入基質(zhì)輔料，接收池中加入8mL接收液，接收池底部凹槽中放入磁力攪拌子，攪拌速度200rpm，溫度37℃±0.2℃，8h試驗(yàn)結(jié)束后取出全部接收液，即得空白接收液。

接受液標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的配制：精密移取醋酸氟輕松(800mg/L)、醋酸氟輕松降解物對照品(800mg/L)、水楊酸(8000mg/L)、間苯二酚儲備液(8000mg/L)各65.0μL置于EP管中，加空白接收液740.0μL，渦旋15s，得醋酸氟輕松、醋酸氟輕松降解物對照品、水楊酸、間苯二酚濃度分別為52、52、520、520mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白接收液逐級稀釋，得含醋酸氟輕松和醋酸氟輕松降解物對照品濃度分別為32、16、8、4、2.4、1.2mg/L及含水楊酸和間苯二酚濃度分別為320、160、80、40、24、12mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取醋酸氟輕松(800mg/L)36.0μL置于EP管中，加空白接收液764.0μL，渦旋15s，得醋酸氟輕松濃度為36mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白接收液逐級稀釋，得含醋酸氟輕松為24、16、8、4、2、1mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別繪制醋酸氟輕松、醋酸氟輕松降解物、水楊酸和間苯二酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線。

醋酸氟輕松的回歸方程為：A=26497.6c+990.987，R=0.9993857，線性范圍為1～36mg/L；

醋酸氟輕松降解物的回歸方程為：A=25336.5c-3188.42，R=0.9996386，線性范圍為1.2～52mg/L；

水楊酸的回歸方程為：A=A=44395.5c+62797.9，R=0.9961814，線性范圍為12～520mg/L；

間苯二酚的回歸方程為：A=2538.38c+2169.12，R=0.9993312，線性范圍為12～520mg/L。

2.1.3結(jié)果

根據(jù)HPLC的得出的各物質(zhì)濃度計(jì)算累積透過量。計(jì)算公式如下：

其中Cn為取樣時藥物在接收液中的濃度(mg/L)；V為接收液的體積(8mL)；Ci為第i點(diǎn)測定的接收液藥物的濃度(mg/L)；Vi為每次取樣體積(0.9 mL)；S為有效透過面積(3.14cm2)。

3批次復(fù)方醋酸氟輕松酊劑的累積透過量如圖1所示，經(jīng)離體豬皮透皮8 h后均未能檢測出醋酸氟輕松降解物和醋酸氟輕松，表明醋酸氟輕松降解物和醋酸氟輕松不經(jīng)皮吸收。受試酊劑1和受試酊劑2中的間苯二酚和水楊酸在離體豬皮中的累積透過量比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。受試酊劑2和受試酊劑3中的間苯二酚和水楊酸在離體豬皮中的累積透過量比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此不同的工藝以及外加醋酸氟輕松降解物對酊劑的累積透過量沒有影響。

圖1 復(fù)方氟輕松酊劑經(jīng)皮透過藥物累積透過量(A)醋酸氟輕松(B)醋酸氟輕松降解物(C)間苯二酚(D)水楊酸

2.2 離體豬皮膚表面剩余酊劑含量測定試驗(yàn)

8h后終止復(fù)方醋酸氟輕松酊離體豬皮膚滲透試驗(yàn)后，用適量甲醇洗滌皮膚，合并洗液至1.0mL棕色容量瓶，定容至刻度，搖勻，即得皮膚表面剩余酊劑樣品。取皮膚表面剩余酊劑樣品用甲醇稀釋(1701122201、1801090302、1801090303稀釋倍數(shù)分別為1、2、2)倍后取100μL 12000rpm離心5min取上清進(jìn)樣分析，測定醋酸氟輕松和醋酸氟輕松降解物的含量；取皮膚表面剩余酊劑樣品用甲醇稀釋10倍，取100μL 12000rpm離心5min取上清進(jìn)樣分析，測定間苯二酚和水楊酸的含量。皮膚用濾紙吸干表面溶劑，置于2℃～10℃保存，待測。

2.2.1含量測定的色譜條件

色譜柱：Venusil ASB C18(50×4.6mm，5μm)；保護(hù)柱：phenomenex C18(4.0×3.0 mm，5 μm)；流動相：A相：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇—乙腈溶液(5∶1，v/v)；按表2梯度洗脫：流速：0.7mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：240nm(間苯二酚)、270nm(水楊酸、醋酸氟輕松降解物對照品、醋酸氟輕松)；進(jìn)樣量：10μL。

表2 提取液的梯度洗脫程序

2.2.2溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制方法同2.1.2。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密移取醋酸氟輕松(800mg/L)、醋酸氟輕松降解物(800mg/L)各250.0μL，水楊酸(8000mg/L)、間苯二酚儲備液(8000mg/L)各50.0μL置于EP管中，加甲醇400.0μL，渦旋15s，得醋酸氟輕松、醋酸氟輕松降解物、水楊酸、間苯二酚濃度分別為200、200、400、400mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白提取液逐級稀釋，得含醋酸氟輕松和醋酸氟輕松降解物濃度分別為60、15、7.5、3、1、0.5mg/L及含水楊酸和間苯二酚濃度分別為120、30、15、6、2、1mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

醋酸氟輕松的回歸方程為：A=31841.2c-752.221，R=0.9956733，線性范圍為0.5～200mg/L；

醋酸氟輕松降解物的回歸方程為：A=28678.4c-1086.39，R=0.9958931，線性范圍為0.5～200mg/L；

間苯二酚的回歸方程為：A=13897.3c+730.058，R=0.9963120，線性范圍為1～400mg/L；

水楊酸的回歸方程為：A=44143.5c+6564.98，R=0.9995123，線性范圍為1～400mg/L。

2.2.3結(jié)果

按“2.2”項(xiàng)下所述方法制備皮膚表面剩余酊劑樣本，進(jìn)液相分析間苯二酚、水楊酸、醋酸氟輕松、醋酸氟輕松降解物的濃度。皮膚用濾紙吸干表面溶劑，置于2℃～10℃保存，待測。計(jì)算皮膚表面剩余量結(jié)果如圖2所示：1701122201、1801090302、1801090303三個批號醋酸氟輕松(Mean±SD)分別為：6.854±0.584、13.292±0.512、13.777±0.425 ±g；醋酸氟輕松降解物(Mean±SD)分別為：2.068±0.170、3.950±0.128、4.001±0.136μg；間苯二酚(Mean±SD)分別為：3 430.715±182.292、3 619.303±204.211、3 485.035±110.507μg；水楊酸(Mean±SD)分別為：1752.543±98.363、1828.032±83.924、1759.510±49.080μg。

圖2 復(fù)方氟輕松酊劑皮膚剩余量(A)醋酸氟輕松(B)醋酸氟輕松降解物(C)間苯二酚(D)水楊酸

2.3 離體豬皮膚滯留量試驗(yàn)

仔細(xì)剪掉皮膚周邊非有效透過面上的皮膚，將含藥皮膚，剪碎成約1mm見方的小顆粒，置EP管中，第一次用2mL甲醇提取后定容至2.0mL棕色容量瓶，取100μL12000rpm離心5min取上清進(jìn)樣分析，利用HPLC法測定醋酸氟輕松降解物的含量；第二次用2mL甲醇及第三次用4mL甲醇提取后，合并前三次提取液定容至10.0mL棕色容量瓶，取100μL12000rpm離心5min取上清進(jìn)樣分析，用HPLC法測定醋酸氟輕松的含量；第四次用4mL甲醇、第五次用8mL甲醇及第六次用8mL甲醇提取后，合并前六次提取液定容至50.0mL棕色容量瓶，取100μL12000rpm離心5min取上清進(jìn)樣分析，利用HPLC測定水楊酸和間苯二酚的含量。

2.3.1含量測定的色譜條件

色譜條件如2.2.1。

2.3.2溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制方法同2.1.2。

空白提取液的制備：取基質(zhì)輔料透皮后的皮膚，輕輕吸取角質(zhì)層面上基質(zhì)輔料，用適量甲醇洗滌3次，用濾紙吸干皮膚表面溶劑，置于2～10℃保存。取出皮膚，仔細(xì)剪掉皮膚周邊非有效透過面上的皮膚，將含藥皮膚剪碎成約1mm見方的小顆粒，置EP管中，加2mL甲醇超聲10min、第二次加2mL甲醇超聲10min、第三次加4mL甲醇超聲10min、第四次加4mL甲醇超聲10min、第五次加8mL甲醇超聲10min、第六次加8mL甲醇超聲10min，合并6次提取液至50.0mL棕色容量瓶并定容，即得空白提取液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密移取醋酸氟輕松(800mg/L)、醋酸氟輕松降解物(800mg/L)各250.0μL，水楊酸(8000mg/L)、間苯二酚儲備液(8000mg/L)各50.0μL置于EP管中，加空白提取液400.0μL，渦旋15s，得醋酸氟輕松、醋酸氟輕松降解物、水楊酸、間苯二酚濃度分別為200、200、400、400mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白提取液逐級稀釋，得含醋酸氟輕松和醋酸氟輕松降解物濃度分別為60、15、7.5、3、1、0.5mg/L及含水楊酸和間苯二酚濃度分別為120、30、15、6、2、1mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

醋酸氟輕松的回歸方程為：A=34222.5c-758.699，R=0.9964425，線性范圍為0.5～200mg/L；

氟輕松的回歸方程為：A=56251.4c-19.7964，R=0.9975570，線性范圍為0.5～200mg/L；

間苯二酚的回歸方程為：A=16377.7c+1160.71，R=0.9970047，線性范圍為1～400mg/L；

水楊酸的回歸方程為：A=51009.0c+12542.0，R=0.9969745，線性范圍為1～400mg/L。

2.3.3結(jié)果

按“2.3”項(xiàng)下所述方法制備提取液樣本，利用HPLC測定皮膚滯留藥物濃度，根據(jù)藥物濃度按照如下公式計(jì)算皮膚中的藥物滯留量：

藥物滯流量=VCt/S

其中Ct為t時間皮膚樣品處理后測得的濃度(mg/L)，V為皮膚萃取后稀釋的體積(mL)，S為有效透過面上的皮膚面積(3.14cm2)。

3批次的復(fù)方醋酸氟輕松酊藥物滯留量結(jié)果如圖3所示，受試酊劑1和受試酊劑2中的間苯二酚和水楊酸在離體豬皮中的皮膚滯留量比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而受試酊劑1中的醋酸氟輕松在離體豬皮中的皮膚滯留量顯著高于受試酊劑2(P≤0.01)。受試酊劑2和受試酊劑3中的醋酸氟輕松、間苯二酚和水楊酸在離體豬皮中的皮膚滯留量比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對于醋酸氟輕松降解物的滯留量，受試酊劑1中6份平行樣中有3份能提取到醋酸氟輕松降解物，受試酊劑2中6份平行樣中有1份能提取到醋酸氟輕松降解物，受試酊劑3中6份平行樣中有6份能提取到醋酸氟輕松降解物。說明受試酊劑1和2中均有醋酸氟輕松降解物的情況發(fā)生，且受試酊劑1降解情況較受試酊劑2嚴(yán)重。

圖3 復(fù)方氟輕松酊劑皮膚滯留量(A)醋酸氟輕松(B)醋酸氟輕松降解物(C)間苯二酚(D)水楊酸

2.4 物質(zhì)平衡

試驗(yàn)酊劑在離體豬皮上完成8h透皮試驗(yàn)后，收集接收液、皮膚提取液和皮膚表層殘留酊劑，分別測定其中藥物含量，與給藥量比較，計(jì)算總體回收率。醋酸氟輕松和醋酸氟輕松降解物、間苯二酚以及水楊酸的回收率結(jié)果如表3、4、5所示。

表3 復(fù)方醋酸氟輕松酊劑中醋酸氟輕松+醋酸氟輕松降解物總體回收率

表4 復(fù)方醋酸氟輕松酊劑中間苯二酚的總體回收率

表5 復(fù)方醋酸氟輕松酊劑中水楊酸的總體回收率

3批試驗(yàn)酊劑(批號1701122201、1801090302、1801090303)中間苯二酚的回收率分別為75.45%±6.75%，75.62%±8.06%，69.64%±5.68%；水楊酸的回收率分別為90.94%±8.76%，91.43%±9.12%，80.45%±10.66%；醋酸氟輕松+醋酸氟輕松降解物的回收率分別為80.38%±9.32%，74.58%±9.78%，77.54%±12.02%。3批試驗(yàn)酊劑各物質(zhì)的回收率相差小于15%，說明實(shí)驗(yàn)操作平行性較好。

3 討論

通過對復(fù)方醋酸氟輕松酊劑受試酊劑工藝1和受試酊劑工藝2以及受試酊劑工藝3同配方工藝2中加入12%的醋酸氟輕松降解物進(jìn)行離體豬皮透皮實(shí)驗(yàn)，8h后均未檢測到氟輕松和醋酸氟輕松，表明氟輕松和醋酸氟輕松不經(jīng)皮吸收。因此推斷復(fù)方醋酸氟輕松酊可能通過皮膚外用發(fā)揮藥效。其中受試酊劑工藝1和受試酊劑工藝2中的間苯二酚和水楊酸在離體豬皮中的皮膚滯留量比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但受試酊劑工藝1中的醋酸氟輕松成分在皮膚中的滯留量顯著高于受試酊劑工藝2，所以受試酊劑工藝1和受試酊劑工藝2透皮行為具有差異性，表明降解產(chǎn)物對受試酊劑中醋酸氟輕松在離體豬皮中的皮膚滯留有較大影響；受試酊劑2和受試酊劑3中的醋酸氟輕松降解物、間苯二酚和水楊酸成分在離體豬皮中的皮膚滯留量比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究考察了復(fù)方醋酸氟輕松酊的體外經(jīng)皮滲透特性，結(jié)果顯示，降解產(chǎn)物不同會影響受試酊劑主要成分醋酸氟輕松的皮膚滯留量，從而導(dǎo)致受試酊劑的透皮行為具有差異性，為復(fù)方醋酸氟輕松酊進(jìn)一步安全性和有效性評價提供數(shù)據(jù)支持，也為產(chǎn)品穩(wěn)定性研究提供思路。