王紅梅 王立光 劉新星 李淑潔 石有太 李忠旺

摘要：病毒病是引起蘭州百合產(chǎn)量下降、品種退化的主要原因，準(zhǔn)確、高效的病毒檢測(cè)技術(shù)在百合脫毒種球生產(chǎn)和推廣應(yīng)用中十分重要。根據(jù)CMV、LSV和LMoV病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，以百合18S rRNA為內(nèi)參照，建立蘭州百合病毒RT-PCR、二重RT-PCR檢測(cè)體系。對(duì)蘭州百合主栽區(qū)病毒病的抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CMV、LSV帶毒率分別達(dá)到98%、100%，LMoV檢出率在不同時(shí)期樣品中存在較大差異。

關(guān)鍵詞：蘭州百合;病毒檢測(cè);反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);病毒病調(diào)查

Abstract：Virus disease is the main cause of yield decline and variety degradation of Lilium davidii Var. unicolor. It is very important to master efficient virus detection technologies in the production of virus-free bulb seedball and planting period. The PCR primers were designed according to the sequences of CMV， LSV and LMoV virus coat protein genes， and the virus detection system of RT-PCR and double RT-PCR was established with lily 18S rRNA as internal reference in this study. The results showed that sampling survey of Lilium davidii Var. unicolor. virus disease in main planting area， CMV and LSV were 98% and 100% respectively， and detection rates of LMoV were different in different periods samples.

Key words：Lilium davidii Var. unicolor; Virus detection; RT-PCR; Virus survey

蘭州百合（Lilium davidii Var. unicolor）屬百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生球根類草本植物，是蘭州市最具特色的名優(yōu)特農(nóng)產(chǎn)品之一，為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)? ? ?品[1 ]，2014年“蘭州百合”被國(guó)家工商總局認(rèn)定為“中國(guó)馳名商標(biāo)”[2 ]。蘭州百合因鱗莖瓣大肉厚，色澤潔白如玉，味醇香甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，藥食同源，素有“蘭州百合甲天下”之美譽(yù)[3 ]。與其他旱地農(nóng)作物相比，蘭州百合在經(jīng)濟(jì)效益上有著明顯的優(yōu)勢(shì)，2016年僅蘭州市七里河區(qū)西果園百合種植面積0.38萬(wàn)hm2，產(chǎn)量0.197萬(wàn)t，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)值達(dá)8.36億元。蘭州百合多年來(lái)靠對(duì)自然生長(zhǎng)的母籽進(jìn)行繁育， 種球退化導(dǎo)致蘭州百合產(chǎn)量下降，尤其病毒病是引起蘭州百合產(chǎn)量下降、品種退化的主要原因[4 ]，準(zhǔn)確、高效的病毒檢測(cè)技術(shù)在百合脫毒種球生產(chǎn)中十分重要。近年來(lái)蘭州百合種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，但由于種源退化問(wèn)題引起百合產(chǎn)量不穩(wěn)定、品質(zhì)良莠不齊、價(jià)格大幅度波動(dòng)、市場(chǎng)萎縮等現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了蘭州百合產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。生產(chǎn)用百合種球繁殖通過(guò)籽球、鱗片扦插等方式進(jìn)行， 而長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖極易造成病毒病害的傳播和積累， 一般發(fā)病率在65%～70%，二代種球的帶病率在95%以上[5 ]。百合感染病毒后終身帶毒，病毒侵入會(huì)破壞植株正常的生理機(jī)制，出現(xiàn)花葉、矮化、畸形、壞死等癥狀，致使生長(zhǎng)衰弱、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、種性退化，一般種植2 a后失去商品價(jià)值[6 ]。植物病毒分布廣、繁殖快、防治難，有植物“癌癥”之稱。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因病毒病導(dǎo)致的糧食作物損失高達(dá)200億美元，經(jīng)濟(jì)作物因病毒病造成的損失每年高達(dá)600億美元[7 - 8 ]。據(jù)調(diào)查，浸染百合的病毒種類有20多種，危害蘭州百合的主要病毒有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、百合無(wú)癥病毒（Lily symptomless virus， LSV）、百合斑駁病毒（Lily mottle virus， LMoV）3種[9 - 10 ]。目前，生產(chǎn)和應(yīng)用脫毒種球是控制蘭州百合病毒病的有效途徑，而準(zhǔn)確、高效的病毒檢測(cè)手段是百合脫毒種球生產(chǎn)環(huán)節(jié)的核心技術(shù)。

植物病毒檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)法、電子顯微鏡法、血清學(xué)檢測(cè)法和分子生物學(xué)方法等，不同方法在時(shí)效性、可操作性、準(zhǔn)確性、靈敏度等方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。RT-PCR技術(shù)因特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在百合病毒檢測(cè)方面得到了一定的應(yīng)用[9 - 12 ]。由于研究材料來(lái)源和試驗(yàn)條件的不同，我們?cè)缙谠梃b前人的研究成果用于蘭州百合病毒檢測(cè)，但出現(xiàn)PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期不符，或者無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物等問(wèn)題。我們又以蘭州百合主栽區(qū)病毒病危害嚴(yán)重的植株為材料，根據(jù)CMV、LSV和LMoV病毒外殼蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，以百合18S rRNA為參照，改進(jìn)了蘭州百合RT-PCR病毒檢測(cè)技術(shù)體系，以期為百合脫毒種苗和種球的生產(chǎn)以及田間病毒病調(diào)查研究提供技術(shù)支持。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料來(lái)源

供試蘭州百合分別從主栽區(qū)七里河區(qū)西果園鄉(xiāng)、榆中縣園子岔鄉(xiāng)和永靖縣關(guān)山鄉(xiāng)采集。田間調(diào)查發(fā)病情況，選取發(fā)病嚴(yán)重的植株采集新鮮葉片，保存于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室用于RNA提取。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 總RNA的提取? ? 稱取0.15 g 百合葉片在液氮中研磨。RNA提取按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的DP441 RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果;RNA反轉(zhuǎn)錄參照天根 KR116 FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，RNA和cDNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)在超微量分光光度計(jì)NanoDropTM ONE上進(jìn)行。采用RNase-Free ddH2O將樣品cDNA稀釋到50 ng/uL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? ? 引物設(shè)計(jì)? ? 根據(jù)NCBI Genbank登錄的百合CMV、LSV、LMoV病毒外殼蛋白基因序列和百合18S rRNA基因序列保守區(qū)段，應(yīng)用Primer premier 5.0 軟件和Oligo 6.22軟件設(shè)計(jì)引物，分別設(shè)計(jì)CMV引物4對(duì)、LSV引物3對(duì)、LMoV引物5對(duì)。百合18S rRNA引物參照張玉寶等[11 ]的方法，引物委托北京Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3? ? RT-PCR、多重RT-PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)? ? 首先采用百合18S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為15 μL：模板cDNA 0.5 μL（25 ng），2×Taq PCR MasterMix（中科瑞泰北京生物科技有限公司）7.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmoL/L），ddH2O 5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，42～60 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸40 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應(yīng)在BIO-RAD T100TM型擴(kuò)增儀中進(jìn)行，PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，1×TAE緩沖液，100 V穩(wěn)壓電泳大約30 min，采用BIO-RAD ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

通過(guò)上述方法對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序優(yōu)化，確定不同引物退火溫度，篩選出特異性高、穩(wěn)定性好、PCR產(chǎn)物電泳條帶亮度強(qiáng)的引物。選擇使用退火溫度一致、擴(kuò)增片段差別較大的引物建立多重PCR，PCR擴(kuò)增體系為30 μL：模板cDNA 1 μL（50 ng），2×Taq PCR MasterMix（中科瑞泰北京生物科技有限公司）15 μL，第1組上下游引物各1 μL，第2組上下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)程序、產(chǎn)物檢測(cè)與成像方法同上。

1.2.4? ? RT-PCR產(chǎn)物回收和測(cè)序? ? 采用天根Universal DNA 純化回收試劑盒對(duì)百合病毒RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆，送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用NCBI Blast軟件進(jìn)行同源性比較分析。

1.2.5? ? 田間病毒病調(diào)查? ? 在蘭州百合苗期（5月中旬）和植株停止生長(zhǎng)期（9月上旬），從百合主栽區(qū)（西果園鄉(xiāng)、園子岔鄉(xiāng)、關(guān)山鄉(xiāng)）不同田塊，隨機(jī)各選取50株百合采集葉片，保存于液氮中帶回以備檢測(cè)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?百合葉片總RNA提取

百合葉片總RNA提取后，采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定了波長(zhǎng)230、260、280 nm下的吸光度，吸光值OD260/OD280在1.8～ 2.1范圍內(nèi)，說(shuō)明提取的RNA蛋白或其他有機(jī)溶劑基本去除干凈;OD260/OD230>2.0，表明無(wú)異硫氰酸胍殘留。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰亮度強(qiáng)，5S條帶較弱（圖1），無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明 RNA完整性較好，符合下一步RNA反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)要求。cDNA第一鏈合成后采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定了濃度，濃度范圍800～? ?1 000 ng/uL內(nèi)，完全能夠滿足PCR擴(kuò)增需求。

2.2? ?百合病毒特異性引物篩選

以百合18S rRNA引物作為內(nèi)參照，對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物出現(xiàn)了大約300 bp的目標(biāo)片段（圖2），證明提取的百合RNA質(zhì)量可信。進(jìn)一步通過(guò)采用梯度PCR和調(diào)整反應(yīng)程序，從設(shè)計(jì)的百合CMV、LSV、LMoV三種病毒引物中，篩選到了5對(duì)目標(biāo)條帶清晰、重復(fù)性好的特異性引物可用于百合病毒檢測(cè)（表1）。

2.3? ?百合病毒多重RT-PCR體系建立

以前期建立的單重RT-PCR體系為基礎(chǔ)，綜合考慮各引物退火溫度、目標(biāo)片段大小和條帶清晰度等因素組配多重PCR，擴(kuò)大PCR反應(yīng)體系到30 uL，在退火溫度為58 ℃時(shí)引物A1和B2在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增，電泳檢測(cè)顯示兩條清晰的擴(kuò)增片段，與預(yù)期736 bp的LSV和248 bp 的CMV片段大小相相吻合（圖3），說(shuō)明該二重PCR具有較高的特異性，可用于蘭州百合CMV、LSV病毒檢測(cè)研究。LMoV引物C1擴(kuò)增產(chǎn)物（252 bp）與CMV（248 bp）、18S rRNA（303 bp）的PCR產(chǎn)物片段大小接近，電泳條帶難以區(qū)分，還需要設(shè)計(jì)更為理想的引物。

2.4? ?RT-PCR產(chǎn)物序列分析

對(duì)百合病毒CMV、LSV、LMoV PCR擴(kuò)增片段測(cè)序，測(cè)得全長(zhǎng)序列分別為248、736、252 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度一致。采用NCBI Blast軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CMV序列與與已報(bào)道的11個(gè)百合病毒序列同源性達(dá)98%，LSV序列與已報(bào)道的14個(gè)百合病毒序列同源性達(dá)99%，LMoV序列與8個(gè)百合病毒序列同源性達(dá)97%。序列比對(duì)同源性很高，說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)合成的引物擴(kuò)增得到的基因片段確為百合CMV、LSV 和LMoV，這些引物可用于百合病毒檢測(cè)。

2.5? ?蘭州百合病毒病田間發(fā)生情況

于5月中旬和9月上旬從蘭州百合主栽區(qū)取樣，分別以A1、B2和C1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，CMV、LSV檢出率在兩批樣品之間沒(méi)有明顯差異，合計(jì)檢出率分別為98%、100%，說(shuō)明CMV和LSV感染率非常高，是浸染蘭州百合的主要病毒。LMoV在5月中旬的樣品中帶毒率為80%，在9月初已停止生長(zhǎng)、近乎枯萎的樣品檢出率為16%，LMoV檢出率在不同時(shí)期樣品中存在較大差異（圖4）。

3? ?結(jié)論與討論

根據(jù)genbank登錄的百合病毒外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)新的引物，篩選出重復(fù)性好、能特異性檢測(cè)CMV的引物2對(duì)、LSV引物2對(duì)、LMoV引物1對(duì)，可用于蘭州百合病毒檢測(cè)。優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件是保證RT-PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。本研究采用2×Taq PCR MasterMix，通過(guò)試驗(yàn)確定模板cDNA和引物濃度，設(shè)置溫度梯度篩選適宜的引物退火溫度。在保證每一對(duì)單獨(dú)引物與模板能夠特異性地產(chǎn)生產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，根據(jù)退火溫度接近、具有高度特異性的目標(biāo)片段，且不同擴(kuò)增片段能有效區(qū)分的原則建立多重PCR體系。最終CMV引物A1和LSV引物B2在同一PCR反應(yīng)體系中得到了特異性擴(kuò)增，取得了與預(yù)期片段大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物。二重RT-PCR技術(shù)的建立，可提高蘭州百合CMV和LSV檢測(cè)效率、降低試驗(yàn)成本，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

研究結(jié)果表明，蘭州百合田間病毒病CMV、LSV檢測(cè)結(jié)果在2批樣品之間沒(méi)有明顯差異，檢出率分別為98%、100%，說(shuō)明蘭州百合主要感染病毒為CMV和LSV，這與王發(fā)林等[13 ]的研究一致。LMoV檢出率在不同時(shí)期樣品中存在較大差異，5月中旬苗期樣品檢出率為80%，9月初已停止生長(zhǎng)的樣品檢出率為16%，說(shuō)明LoMV檢出率與植株發(fā)育時(shí)期有關(guān)。百合病毒病發(fā)病程度與寄主生長(zhǎng)周期呈正相關(guān)，其發(fā)生受多種條件影響，如溫度、生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、傳毒介體等，如溫度是百合病害病發(fā)生有重要影響的環(huán)境因素之一[14 - 16 ]。有研究認(rèn)為，氣溫在20 ℃以下時(shí)，百合發(fā)病程度較輕，但隨氣溫升高百合發(fā)病程度不斷加重，當(dāng)氣溫達(dá)到35 ℃以上時(shí)病情開(kāi)始減輕，并隨著持續(xù)高溫出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象[16 - 17 ]。百合苗期很容易感染病毒病，發(fā)病率和病情指數(shù)不斷升高，在顯蕾期發(fā)病率最高，病情指數(shù)也較高，在花期出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象[14 ]。一般植物病毒只有在寄主活體內(nèi)才具有活性，僅少數(shù)植物病毒可在病株殘?bào)w中保持活性幾天或幾個(gè)月，病毒入侵與植物調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程以及生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)的抗病毒機(jī)制有關(guān)[18 ]。因此，百合病毒檢測(cè)率高低與病毒活性及對(duì)寄主入侵機(jī)制相關(guān)。

病毒病是無(wú)性繁殖植物的常見(jiàn)病害，其分布廣、危害大， 且多為復(fù)合感染，主要通過(guò)蚜蟲(chóng)等昆蟲(chóng)媒介和土壤、機(jī)械損傷傳播，傳播速度快，有日益嚴(yán)重的趨勢(shì)。植物病毒病防治方法主要有抗病毒育種、使用化學(xué)農(nóng)藥和推廣應(yīng)用脫毒種苗，但抗病育種存在基因資源匱乏、育種周期長(zhǎng)、效率低下，使用化學(xué)藥劑或生物制劑對(duì)植物病毒病尚不能進(jìn)行直接有效防治[19 ]。因此，生產(chǎn)和種植脫毒種苗，進(jìn)行“無(wú)毒化”栽培成為控制植物病毒病的主要措施，而準(zhǔn)確、高效的病毒檢測(cè)是把好種源關(guān)、實(shí)現(xiàn)“無(wú)毒化”栽培必不可少的首要環(huán)節(jié)。

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（本文責(zé)編：楊? ? 杰）