張曙光　孫紅緒　王彥芬

摘要：為了摸清五峰馬里蘭煙草花葉病毒病的發(fā)生情況，采用田間調(diào)查和實驗室RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了TMV、CMV和PVY的感染情況檢測。結(jié)果表明，在五峰馬里蘭煙區(qū)發(fā)生的煙草花葉病常表現(xiàn)為TMV、CMV與PVY的復(fù)合感染，復(fù)合感染率為50%。其中，以TMV感染為主，檢出率為100%；其次是CMV感染，檢出率為50%；然后是PVY感染，檢出率為40%。

關(guān)鍵詞：五峰馬里蘭煙區(qū)；煙草花葉??；病毒檢測； RT-PCR

中圖分類號：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3809-03

Abstract：In order to find out the occurrence of tobacco mosaic diseases in Maryland tabacco areas of Wufeng county，the infection of TMV，CMV and PVY was detected with RT-PCR technology and field investigation. The results showed that mixed infection with three viruses usually had complex symptom and the mixed infection rate was about 50%. The virus with the highest detection rate（100%）was TMV，followed by CMV and PVY with the detection rate of 50% and 40%，respectively.

Key words： Wufeng Maryland tobacco areas；tabacco mosaic disease；virus detection.

煙草花葉病毒病俗稱煙草花葉病，是目前煙草產(chǎn)區(qū)分布最廣、發(fā)生最為普遍的一類病害。1989～1991年進(jìn)行的全國煙草侵染性病害調(diào)查表明，引起煙草病毒病的病毒共有17種[1]。據(jù)李錫宏等[2]調(diào)查，在湖北煙區(qū)發(fā)生的花葉病毒病主要是煙草普通花葉?。═MV）、黃瓜花葉?。–MV）和馬鈴薯Y病毒?。≒VY），馬里蘭煙以CMV和PVY感染為主。近幾年來，五峰馬里蘭煙草花葉病毒病連年發(fā)生，且呈逐年加重趨勢，已成為危害煙草的一種主要病害，嚴(yán)重影響了五峰煙葉生產(chǎn)。為了進(jìn)一步摸清五峰馬里蘭煙草花葉病毒病的發(fā)生情況，更有效地開展防治，進(jìn)行了煙草花葉病毒病調(diào)查與病毒檢測。

1 材料與方法

1.1 田間調(diào)查與取樣

在湖北省五峰縣王家坪村馬里蘭煙葉示范基地田間進(jìn)行調(diào)查與取樣，于5～8月采取系統(tǒng)調(diào)查與隨機(jī)調(diào)查相結(jié)合，調(diào)查煙草花葉病毒病發(fā)病率，觀察記載不同癥狀的發(fā)生情況。

在發(fā)病煙株上選取10份分別表現(xiàn)為脈明、斑駁、花葉、黃化、皺縮、卷曲等典型癥狀的新鮮煙草葉片，用保鮮膜包裹帶回實驗室檢測。

1.2 引物

4種引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，詳情見表1。

1.3 RNA提取

采樣柱式分離方法提取RNA，步驟為：取待檢材料嫩葉0.1 g，加液氮研磨成粉狀，快速轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入800 μL SDS提取緩沖液，劇烈搖晃至混勻，65 ℃水浴5 min后離心，加入800 μL Binding Buffer混勻并加入400 μL無水乙醇，將混勻后的溶液加入吸附柱中。分別加入700 μL Wash Buffer和700 μL 80%乙醇洗滌（2次），風(fēng)干后，溶于50 μL無菌水，-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增

以提取的總RNA為模板，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20 μL，含5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、dNTPs （5 μmol/μL）1 μL、RNA酶抑制劑（RNasin，40 U/μL） 0.5 μL、M-MLV （200 U/μL） 0.5 μL、隨機(jī)引物（100 pmol/μL）1 μL、RNA模板3 μL和DEPC處理水10 μL。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，含10×PCR溶液2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）[寶生物工程（大連）有限公司]0.2 μL、正向和反向引物各0.5 μL（10 μmol/L）、總核酸1 μL和滅菌的去離子水。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳后在EB中染色10 min，將其置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物克隆及測序

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切取含目標(biāo)產(chǎn)物的凝膠，按瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒（V3.0，北京道普生物科技有限公司）說明回收目標(biāo)DNA，與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含50 mg/L氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)過夜。待菌落長出后隨機(jī)挑取一定數(shù)量的白色單菌落，在含50 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，PCR鑒定為陽性克隆后，將菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間煙草花葉病毒病調(diào)查結(jié)果

根據(jù)2012-2013年在五峰馬里蘭煙區(qū)的田間系統(tǒng)調(diào)查，煙草花葉病毒病一般始發(fā)于5月中下旬至6月上旬，7月上中旬達(dá)到發(fā)病高峰期。一般發(fā)病率為30%～40%，重病田發(fā)病率可達(dá)70%～80%。癥狀表現(xiàn)為脈明、退綠、斑駁、花葉、黃化、皺縮、卷曲等多樣化典型病毒癥狀，說明田間癥狀具有復(fù)雜性，并存在大量復(fù)合感染。在感染病毒的植株中下部成熟煙草葉片上癥狀不明顯，出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象，僅在頂端嫩葉上呈現(xiàn)典型病毒病癥狀。

2.2 煙草花葉病毒病類型檢測

利用RT-PCR技術(shù)對10份新鮮煙葉病害標(biāo)本進(jìn)行TMV、CMV和PVY的感染情況檢測（表2）。各選取一個病毒分離物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，序列分析結(jié)果顯示，各病毒擴(kuò)增片段與GenBank登錄的相應(yīng)病毒的核苷酸序列相似性達(dá)97%以上，確認(rèn)檢測結(jié)果正確。

2.2.1 黃瓜花葉病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2對CMV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到5份為陽性（圖1），檢出率為50%。

2.2.2 煙草花葉病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物TMV mpf/3nr對TMV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到10份為陽性（圖2），檢出率為100%。

2.2.3 馬鈴薯Y病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物PVY P5/P3對PVY進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到4份為陽性（圖3），檢出率為40%。

3 討論

根據(jù)檢測結(jié)果，在五峰馬里蘭煙區(qū)發(fā)生的煙草花葉病常表現(xiàn)為TMV、CMV與PVY的復(fù)合感染，復(fù)合感染率為50%。既有TMV+CMV感染，也有TMV+PVY感染，還可以是TMV+CMV+PVY復(fù)合感染。與張友臣等[7]對十堰市煙草病毒病的調(diào)查“單獨侵染占41.89%，復(fù)合侵染占58.11%”的結(jié)論基本一致。從五峰馬里蘭煙區(qū)引起花葉病的病毒來看，主要以TMV侵染為主，檢出率為100%；其次是CMV侵染，檢出率為50%；然后是PVY侵染，檢出率為40%。與李錫宏等[2]認(rèn)為湖北馬里蘭煙區(qū)煙草花葉病以CMV、PVY感染為主的結(jié)論不同。

由于TMV抗逆性強(qiáng)，能在土壤和糞肥中長時間存活，存在于土壤或肥料中的帶毒煙葉殘體往往是其主要初侵染源，田間主要通過接觸摩擦傳染，整枝打頂、中耕除草等農(nóng)事操作造成的微傷也能引起反復(fù)再侵染，使病害擴(kuò)大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是來自感病的黃瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物，在田間通過蚜蟲傳播，引起病害蔓延。目前在五峰煙區(qū)推廣栽培的五峰1號是由馬里蘭煙609（Md609）選育而來，對TMV、CMV和PVY不具抗性，表現(xiàn)感病[8]。因此，培育無毒煙苗和有效防治蚜蟲成為病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制劑GHA-Virizol、抗性激活劑R12，可以鈍化病毒活性、抑制病毒在植物體內(nèi)增殖，具有一定的防治效果[9]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李懷方，劉鳳權(quán)，郭小密，等.園藝植物病理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2001.

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[3] 徐平東，周仲駒，林奇英，等.黃瓜花葉病毒亞組Ⅰ和Ⅱ分離物外殼蛋白基因的序列分析與比較[J].病毒學(xué)報，1999（2）：164-170.

[4] 劉文洪，洪 健，陳集雙，等.侵染東方百合的黃瓜花葉病毒兩個分離物CP基因克隆和進(jìn)化分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2004（4）：442-445.

[5] 黃金光，鄧叢良，李懷方，等.煙草花葉病毒丁香分離物的分離與鑒定[J].植物病理學(xué)報，2004，34（3）：215-220.

[6] 吳興泉，陳士華，陳 濤，等.河南省馬鈴薯Y病毒的分子檢測與鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（10）：64-66.

[7] 張友臣，李錫宏，雎 韡，等.十堰市煙草病毒病的調(diào)查及防治策略[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（2）：327-330.

[8] 錢祖坤，文光紅，趙傳良，等.馬里蘭煙新品種五峰1號的選育及特征特性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（24）：11972-11973.

[9] 周建國，肖啟明，劉雙清，等，煙草花葉病毒病發(fā)生及防治研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：121-122.

（責(zé)任編輯 陳 焰）

2.2 煙草花葉病毒病類型檢測

利用RT-PCR技術(shù)對10份新鮮煙葉病害標(biāo)本進(jìn)行TMV、CMV和PVY的感染情況檢測（表2）。各選取一個病毒分離物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，序列分析結(jié)果顯示，各病毒擴(kuò)增片段與GenBank登錄的相應(yīng)病毒的核苷酸序列相似性達(dá)97%以上，確認(rèn)檢測結(jié)果正確。

2.2.1 黃瓜花葉病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2對CMV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到5份為陽性（圖1），檢出率為50%。

2.2.2 煙草花葉病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物TMV mpf/3nr對TMV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到10份為陽性（圖2），檢出率為100%。

2.2.3 馬鈴薯Y病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物PVY P5/P3對PVY進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到4份為陽性（圖3），檢出率為40%。

3 討論

根據(jù)檢測結(jié)果，在五峰馬里蘭煙區(qū)發(fā)生的煙草花葉病常表現(xiàn)為TMV、CMV與PVY的復(fù)合感染，復(fù)合感染率為50%。既有TMV+CMV感染，也有TMV+PVY感染，還可以是TMV+CMV+PVY復(fù)合感染。與張友臣等[7]對十堰市煙草病毒病的調(diào)查“單獨侵染占41.89%，復(fù)合侵染占58.11%”的結(jié)論基本一致。從五峰馬里蘭煙區(qū)引起花葉病的病毒來看，主要以TMV侵染為主，檢出率為100%；其次是CMV侵染，檢出率為50%；然后是PVY侵染，檢出率為40%。與李錫宏等[2]認(rèn)為湖北馬里蘭煙區(qū)煙草花葉病以CMV、PVY感染為主的結(jié)論不同。

由于TMV抗逆性強(qiáng)，能在土壤和糞肥中長時間存活，存在于土壤或肥料中的帶毒煙葉殘體往往是其主要初侵染源，田間主要通過接觸摩擦傳染，整枝打頂、中耕除草等農(nóng)事操作造成的微傷也能引起反復(fù)再侵染，使病害擴(kuò)大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是來自感病的黃瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物，在田間通過蚜蟲傳播，引起病害蔓延。目前在五峰煙區(qū)推廣栽培的五峰1號是由馬里蘭煙609（Md609）選育而來，對TMV、CMV和PVY不具抗性，表現(xiàn)感病[8]。因此，培育無毒煙苗和有效防治蚜蟲成為病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制劑GHA-Virizol、抗性激活劑R12，可以鈍化病毒活性、抑制病毒在植物體內(nèi)增殖，具有一定的防治效果[9]。

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[7] 張友臣，李錫宏，雎 韡，等.十堰市煙草病毒病的調(diào)查及防治策略[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（2）：327-330.

[8] 錢祖坤，文光紅，趙傳良，等.馬里蘭煙新品種五峰1號的選育及特征特性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（24）：11972-11973.

[9] 周建國，肖啟明，劉雙清，等，煙草花葉病毒病發(fā)生及防治研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：121-122.

（責(zé)任編輯 陳 焰）

2.2 煙草花葉病毒病類型檢測

利用RT-PCR技術(shù)對10份新鮮煙葉病害標(biāo)本進(jìn)行TMV、CMV和PVY的感染情況檢測（表2）。各選取一個病毒分離物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，序列分析結(jié)果顯示，各病毒擴(kuò)增片段與GenBank登錄的相應(yīng)病毒的核苷酸序列相似性達(dá)97%以上，確認(rèn)檢測結(jié)果正確。

2.2.1 黃瓜花葉病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2對CMV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到5份為陽性（圖1），檢出率為50%。

2.2.2 煙草花葉病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物TMV mpf/3nr對TMV進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到10份為陽性（圖2），檢出率為100%。

2.2.3 馬鈴薯Y病毒RT-PCR檢測結(jié)果 采用引物PVY P5/P3對PVY進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測，從10份煙草樣品中檢測到4份為陽性（圖3），檢出率為40%。

3 討論

根據(jù)檢測結(jié)果，在五峰馬里蘭煙區(qū)發(fā)生的煙草花葉病常表現(xiàn)為TMV、CMV與PVY的復(fù)合感染，復(fù)合感染率為50%。既有TMV+CMV感染，也有TMV+PVY感染，還可以是TMV+CMV+PVY復(fù)合感染。與張友臣等[7]對十堰市煙草病毒病的調(diào)查“單獨侵染占41.89%，復(fù)合侵染占58.11%”的結(jié)論基本一致。從五峰馬里蘭煙區(qū)引起花葉病的病毒來看，主要以TMV侵染為主，檢出率為100%；其次是CMV侵染，檢出率為50%；然后是PVY侵染，檢出率為40%。與李錫宏等[2]認(rèn)為湖北馬里蘭煙區(qū)煙草花葉病以CMV、PVY感染為主的結(jié)論不同。

由于TMV抗逆性強(qiáng)，能在土壤和糞肥中長時間存活，存在于土壤或肥料中的帶毒煙葉殘體往往是其主要初侵染源，田間主要通過接觸摩擦傳染，整枝打頂、中耕除草等農(nóng)事操作造成的微傷也能引起反復(fù)再侵染，使病害擴(kuò)大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是來自感病的黃瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物，在田間通過蚜蟲傳播，引起病害蔓延。目前在五峰煙區(qū)推廣栽培的五峰1號是由馬里蘭煙609（Md609）選育而來，對TMV、CMV和PVY不具抗性，表現(xiàn)感病[8]。因此，培育無毒煙苗和有效防治蚜蟲成為病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制劑GHA-Virizol、抗性激活劑R12，可以鈍化病毒活性、抑制病毒在植物體內(nèi)增殖，具有一定的防治效果[9]。

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[4] 劉文洪，洪 健，陳集雙，等.侵染東方百合的黃瓜花葉病毒兩個分離物CP基因克隆和進(jìn)化分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2004（4）：442-445.

[5] 黃金光，鄧叢良，李懷方，等.煙草花葉病毒丁香分離物的分離與鑒定[J].植物病理學(xué)報，2004，34（3）：215-220.

[6] 吳興泉，陳士華，陳 濤，等.河南省馬鈴薯Y病毒的分子檢測與鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（10）：64-66.

[7] 張友臣，李錫宏，雎 韡，等.十堰市煙草病毒病的調(diào)查及防治策略[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（2）：327-330.

[8] 錢祖坤，文光紅，趙傳良，等.馬里蘭煙新品種五峰1號的選育及特征特性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（24）：11972-11973.

[9] 周建國，肖啟明，劉雙清，等，煙草花葉病毒病發(fā)生及防治研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：121-122.

（責(zé)任編輯 陳 焰）