周元圓，翟秀璋，鐘瑩，杜玉芳，秦雪★

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧；2.南寧市第二人民醫(yī)院，廣西 南寧）

0 引言

染色體畸變是指在孕婦懷孕期間，染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的異常，是目前導(dǎo)致新生兒出生缺陷發(fā)生的主要原因之一[1]。由于傳統(tǒng)核型技術(shù)的限制，對于10 Mb以下的拷貝數(shù)變異不易被識別，因此容易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象，在這樣的前提下，如何有效提高胎兒染色體CNV的檢測準(zhǔn)確率已經(jīng)成為臨床關(guān)注的重點[2]。研究表明，由于高通量技術(shù)的迅速發(fā)展，NIPT不僅可以用于染色體非整倍性的產(chǎn)前篩查，而且在檢測染色體CNV方面具有良好的應(yīng)用價值[3]。對此本次研究針對本院NIPT提示存在染色體CNV的59例孕婦進行胎兒染色體拷貝術(shù)變異檢測，旨在分析其臨床價值，詳見下文所示。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取自2018年1月至2020年8月于本院接受NIPT檢測，提示存在染色體拷貝數(shù)變異的孕婦作為研究對象，其中59例接受介入性產(chǎn)前診斷。年齡18～48歲，平均（32.0±5.5）歲，孕周 12～34周，平均（17.4±3.1）周；所有孕婦均知情研究并自愿加入研究。結(jié)合產(chǎn)前診斷及隨訪結(jié)果進行回顧性分析，對NIPT結(jié)果進行驗證，評估無創(chuàng)產(chǎn)前檢測對胎兒拷貝數(shù)變異檢測的應(yīng)用價值。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及血漿分離

采集孕婦外周血10 mL置Streck Cell-free DNA BCT抗凝管。4 ℃條件下以1600 r/min離心15 min，吸取上清血漿轉(zhuǎn)入2.0 mL低吸附管內(nèi)，再次以4 ℃條件下16000 r/min離心10 min。吸取上清血漿，分裝至置于冰盒上的2 mL離心管中，每管轉(zhuǎn)入約400 μL血漿，放置-20 ℃或-80 ℃冰箱中儲存。

1.2.2 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）

（1）采用核酸提取試劑盒試劑盒提取DNA,通過晶芯胎兒非整倍體檢測試劑盒（博奧晶典生物技術(shù)）對基因組DNA進行文庫構(gòu)建、文庫定量、油包水PCR，ES富集等操作后，采用Life lon Torrent（Bioelectronseq 400）測序平臺進行檢測。

（2）測序結(jié)束后，運用《無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理軟件》對測序數(shù)據(jù)進行分析，得到樣本21號染色體、18號染色體和13號染色體的Z值，根據(jù)每個樣本的Z值判斷樣本的檢測結(jié)果。

1.2.3 拷貝數(shù)變異測序檢測（CNV-Seq）

對NIPT提示染色體拷貝數(shù)變異的孕婦，行羊膜腔穿刺采集10 mL胎兒羊水，根據(jù)染色體異常基因檢測項目的SOP（博奧晶典生物技術(shù)）對樣本進行基因組DNA提?。≦IAamp提取試劑盒）、測序文庫構(gòu)建、文庫定量、上機測序等流程。測序采用Life lon Torrent平臺（Bioelectronseq 400）測序系統(tǒng)進行檢測。通過公共數(shù)據(jù)庫（Decipher、Omim、DGV、ClinGen）對檢測數(shù)據(jù)進行綜合評判，認定CNV是否有臨床意義。

2 結(jié)果

對NIPT提示染色體微小片段缺失、重復(fù)的孕婦進行介入性產(chǎn)前診斷，數(shù)據(jù)顯示，59例NIPT提示CNV的孕婦接受介入性產(chǎn)前診斷，28例經(jīng)CNV-seq檢測到CNV，其中27例與NIPT結(jié)果一致，1例檢測到的CNV結(jié)果不一致，NIPT篩查CNV符合率為45.7%（27/59）。28例樣本中，檢測到17例胎兒缺失，位置與NIPT結(jié)果提示一致，另有1例胎兒額外檢測到其他缺失片段。檢測到11例染色體微重復(fù)，其中10例重復(fù)位置與NIPT結(jié)果一致，1例不一致，另有2例胎兒額外檢測到其他重復(fù)片段。結(jié)果一致的27例中，＜5 Mb有11例，≥5 Mb且＜10 Mb有6例，＞10 Mb有10例。結(jié)果不一致的1例，片段＜5 Mb。因此，NIPT對≥5 Mb的檢測效能佳，結(jié)果基本一致，詳見表1所示。對NIPT提示染色體拷貝數(shù)變異孕婦進行隨訪及結(jié)果分析，其中發(fā)現(xiàn)了1例Angelman/Prader-Willi綜合征、1例貓叫綜合征（Cri du Chat syndrome）及1例22q11微缺失綜合征（22q11 Deletion Syndrome），且NIPT提示的片段大小與CNV結(jié)果高度一致。

表1 無創(chuàng)產(chǎn)前技術(shù)檢測染色體拷貝數(shù)變異的效能（n）

3 討論

染色體拷貝數(shù)變異是先天性生長發(fā)育遲緩，結(jié)構(gòu)畸形及罕見遺傳綜合征的主要病因。可由病毒感染、化學(xué)因子、轉(zhuǎn)移子、重組酶等異常引起，目前胎兒染色體缺失已經(jīng)成為新生兒先天性缺陷的主要遺傳因素之一[4]。由于染色體拷貝數(shù)變異片段相對更小，在臨床以往常規(guī)檢查中不易被發(fā)現(xiàn)，多容易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象。高通量測序是一種新型的技術(shù)測量方式，是在傳統(tǒng)測序的基礎(chǔ)上進行改革后的成果[5]。高通量測序能夠一次性對幾十萬到幾百萬條DNA進行序列測定，針對NIPT提示染色體異常的孕婦進行基因組測序，能夠迅速找到大量的遺傳差異，從而實現(xiàn)遺傳進化分析以及重要性狀候選基因的檢測[6]。此外，高通量測序能夠?qū)ふ业酱罅康慕Y(jié)構(gòu)變異等信息，從而獲取胎兒生物群體的遺傳特征，對胎兒發(fā)育現(xiàn)狀做出判斷[7]。在傳統(tǒng)檢測中，由于需要進行穿刺檢查，增加了孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險，而高通量測序檢測能夠通過孕婦外周血液進行胎兒的基因檢測，并具有對較小缺失片段高靈敏度的優(yōu)勢[8-9]。據(jù)多項研究表明，高通量測序能夠檢測出孕婦外周血中的CNV，甚至最小的檢測染色體缺失體積可達到300kb[10-12]。

本次研究針對本院收治療的提示NIPT存在染色體缺失的59例孕婦進行核型分析及染色體拷貝術(shù)變異檢測。數(shù)據(jù)表明，在59例孕婦檢測結(jié)果中，28例經(jīng)CNV-seq檢測到CNV，其中27例與NIPT結(jié)果一致，1例檢測到的CNV結(jié)果不一致，NIPT篩查CNV符合率為45.7%（27/59）。檢測到17例胎兒缺失，位置與NIPT結(jié)果提示一致，另有1例胎兒額外檢測到其他缺失片段。檢測到11例染色體微重復(fù)，其中10例重復(fù)位置與NIPT結(jié)果一致，1例不一致，另有2例胎兒額外檢測到其他重復(fù)片段。NIPT對≥ 5Mb的檢測效能佳，結(jié)果基本一致。剩余31例胎兒在經(jīng)由多項檢測后仍舊未發(fā)現(xiàn)異常，這可能是由于孕婦機體內(nèi)的血漿成分較為復(fù)雜，因此可能包含了孕婦本身的DNA，所以在對胎兒進行檢測時影響了胎兒的檢測結(jié)果，此外測序數(shù)據(jù)不足等因素也可能導(dǎo)致胎兒檢測結(jié)果異常出現(xiàn)；對NIPT提示染色體拷貝數(shù)變異孕婦進行隨訪及結(jié)果分析，其中發(fā)現(xiàn)了1例Angelman/Prader-Willi綜合征、1例貓叫綜合征（Cri du Chat syndrome）及1例22q11微缺失綜合征（22q11 deletion syndrome），且NIPT提示的片段大小與CNV結(jié)果高度一致?？梢?，在胎兒染色體拷貝數(shù)變異的檢測中應(yīng)用無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)，能夠?qū)Σ糠秩笔屋^小的DNA進行檢測，避免了以往常規(guī)治療中對較小缺失片段漏診現(xiàn)象的出現(xiàn)。在一些典型罕見病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷起到了重要作用。

在劉學(xué)軍等[13]的研究中，對NIPT提示CNV孕婦采取羊膜腔穿刺術(shù)，進行染色體核型分析及CNV-seq，在該學(xué)者的研究數(shù)據(jù)中，確診胎兒染色體缺失或重復(fù)片段與NIPT檢測結(jié)果基本一致，此外，在經(jīng)由NIPT檢測后另發(fā)現(xiàn)較小的缺失片段，分別為2.32 Mb以及6.28 Mb，可見，在染色體缺失或重復(fù)胎兒的臨床檢測中，NIPT不僅能對胎兒的非整倍體進行篩查，同時也能對微小片段的缺失和重復(fù)進行檢測。然而，由于產(chǎn)前診斷標(biāo)本中CNV發(fā)生率較低，臨床樣本數(shù)量有限，仍需要進一步增加研究樣本量，進一步優(yōu)化檢測效能[14]。

綜上所述，無創(chuàng)產(chǎn)前技術(shù)對孕婦胎兒染色體拷貝數(shù)變異進行檢測是可行的，可以幫助臨床醫(yī)師對胎兒的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。對于無法避免的假陽性結(jié)果，仍需要依靠產(chǎn)前診斷及超聲隨訪等進行追蹤及遺傳咨詢[15]。但隨著技術(shù)的改進和CNV致病性相關(guān)數(shù)據(jù)的積累，NIPT技術(shù)有望在產(chǎn)前篩查中發(fā)揮更大的作用。