賀勝，簡瑩娜，王戈平，李秀萍，馬利青

(1.青海省民和縣李二堡鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，民和 810807；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

2020年9月，青海省民和縣松樹鄉(xiāng)某農(nóng)戶從海西州某地購買了154只成年綿羊，運(yùn)回后1周左右，陸續(xù)出現(xiàn)臥地不起，呻吟，腹瀉，有時(shí)出現(xiàn)搖頭等神經(jīng)癥狀。期間雖經(jīng)過治療，但沒有奏效，后送檢至省級(jí)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，診斷為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的綿羊腸毒血癥，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 臨床癥狀

羊只運(yùn)回的第1周表現(xiàn)異常，第2周開始部分羊只出現(xiàn)精神沉郁，腹瀉，先排出暗綠色或者黃棕色的粥狀糞便，散發(fā)惡臭氣味，后變?yōu)橄”?，混有粘液，有腹痛表現(xiàn)。1周后糞便變干呈塊狀，偶見帶血?；佳蚓癯劣?，往往低頭面墻呆立，或獨(dú)自臥在墻角。后期臥地不起，四肢呈游泳狀劃動(dòng)，口吐白沫或流涎水。嚴(yán)重者哀叫而死，共死亡7只。

2 剖檢癥狀

對(duì)其中的5只病死羊進(jìn)行了剖檢。胸腔積液，液體呈淡黃色3/5；心包積液，心臟冠狀溝脂肪有出血點(diǎn)4/4；肝臟腫大，呈土黃色；膽囊充盈，比體積增大1×以上3/5；肺臟腫大、淤血2/2；腎較大，且較軟，呈棕紅色3/5；小腸階段性充血，出血，內(nèi)充滿水樣內(nèi)容物2/5；腸系膜淋巴結(jié)腫大，奶白色3/5；十二指球狀腸膨大部內(nèi)膜有彌散性出血點(diǎn)2/5；胃粘膜脫落，部分有出血斑塊2/5。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 涂片鏡檢

取新鮮病死羊的心、肝、脾、肺、腎、腸淋巴等組織涂片，革蘭氏染色陽性，鏡檢可見兩端鈍圓的粗大桿菌，呈單個(gè)或者2～3個(gè)排列，有莢膜。

3.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將上述無菌采集的心、肝、脾、肺、腎、腸淋巴等組織依次接種至普通肉湯、厭氣肉肝湯和鮮血平板培養(yǎng)基上。經(jīng)24 h培養(yǎng)后，厭氣肉肝湯培養(yǎng)基上有泡沫，培養(yǎng)基變渾濁；鮮血平板培養(yǎng)基上有圓形、表面突起、呈灰白色半透明狀菌落，且在菌落周圍形成溶血環(huán)。厭氣肉肝湯和鮮血培養(yǎng)基培養(yǎng)物染色鏡檢為革蘭氏陽性桿菌。

3.3 生化試驗(yàn)

該菌可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖，但不發(fā)酵甘露醇。可生成硫化氫氣體，甲基紅試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)以及V-P試驗(yàn)都呈陰性，無法利用枸椽酸鹽。

3.4 動(dòng)物試驗(yàn)

取病死羊小腸水樣內(nèi)容物，用1倍量的滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，3,000 rpm 離心10 min，取上清液。選取8只健康15 g左右的實(shí)驗(yàn)小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組各4只。其中，試驗(yàn)組靜脈注射上清液0.2 mL/只共2只；0.5 mL/只共2只；對(duì)照組分別注射生理鹽水0.2 mL/只，0.5 mL/只各2只。結(jié)果0.5 mL/只試驗(yàn)組小鼠在注射上清液后約5 h左右死亡，0.2 mL/只試驗(yàn)組小鼠在注射上清液后約15 h左右死亡，對(duì)照組小鼠都表現(xiàn)正常，說明實(shí)驗(yàn)組腸內(nèi)容物存在毒素。

3.5 PCR檢測(cè)

將分離細(xì)菌進(jìn)行基因組DNA提取，經(jīng)PCR檢測(cè)(引物詳見見表1)，擴(kuò)增出325 bp 的α毒素基因片段和585 bp 的ε毒素基因片段(詳見圖1)，診斷為 D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素檢測(cè)引物表

圖1 分離菌株毒素PCR檢測(cè)結(jié)果圖DL2000 DNAmaker；N-：為陰性對(duì)照；α、β、iota、ε分別為不同的毒素基因。

4 結(jié)論

經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、臨床癥狀、剖檢變化和細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)、腸內(nèi)容物毒素檢查及分離菌株的多重PCR檢測(cè)，此次死亡病例確診為由D型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的綿羊腸毒血癥。

5 防治

羊腸毒血癥也叫做軟腎病，是由于感染D型產(chǎn)氣莢膜梭菌而導(dǎo)致的一種急性非接觸性傳染疾病，D型產(chǎn)氣莢膜梭菌在羊腸道中大量繁殖并產(chǎn)生毒素引起急性毒血癥，可引起羔羊、綿羊、山羊、牛以及灰鼠發(fā)病[1]。由于其具有非常高的死亡率往往給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病羊和帶菌羊是腸毒血癥的傳染來源。腸毒血癥常見經(jīng)口感染，綿羊?qū)υ摬》浅Ｒ赘?，呈散發(fā)狀態(tài)[2]。

本次實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果認(rèn)為該病例是由D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的綿羊腸毒血癥，至于本次病例是在產(chǎn)地，運(yùn)輸過程或運(yùn)回后感染的，有待于進(jìn)一步的調(diào)查。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，專業(yè)人員對(duì)購入羊群進(jìn)行了羊四聯(lián)疫苗的注射工作，注射后很快杜絕了羊腸毒血癥的發(fā)生。病死羊只運(yùn)送至指定地點(diǎn)，挖2m以上深坑，底層倒入生石灰和消毒藥深埋[3]。該菌在自然界及動(dòng)物中廣泛存在，引進(jìn)羊只必須免疫接種羊三聯(lián)或四聯(lián)疫苗，尤其在羊群轉(zhuǎn)場(chǎng)或進(jìn)入換草場(chǎng)之前，加強(qiáng)免疫接種是預(yù)防本病發(fā)生的最為可行的方法[4]。