張學(xué)勇，簡(jiǎn)瑩娜，馬怡雋，付永，沈秀英，郭志宏，陳有錄，林芳明,朵紅

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

仔豬腹瀉是養(yǎng)豬業(yè)中常見(jiàn)的疾病，也是導(dǎo)致仔豬死亡最主要的原因之一，但是引起仔豬腹瀉的因素較多，包括非傳染性因素和傳染性因素。非傳染性因素包括母豬方面的健康狀態(tài)、泌乳情況以及飼養(yǎng)管理因素。仔豬方面包括初乳獲得、誘食補(bǔ)飼及應(yīng)激因素的影響。環(huán)境方面的溫度與濕度，保健衛(wèi)生消毒及氣候驟然變化等[1]。傳染性因素就是致病性病原的作用，如細(xì)菌性病原：C 型魏氏梭菌(仔豬紅痢)、致病性大腸桿菌(仔豬黃痢、仔豬白痢)、豬密螺旋體與腸道內(nèi)厭氧菌(豬血痢)、沙門(mén)氏菌(仔豬副傷寒)、耶爾森氏菌、勞森菌(豬增生性腸炎)等[2]；病毒性病原包括豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬博卡病毒以及呼吸道豬冠狀病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、豬瘟病毒等[3]；寄生蟲(chóng)性病原包括：球蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)、賈第鞭毛蟲(chóng)、線蟲(chóng)等[4]。目前，雖然臨床上治療仔豬腹瀉的藥物很多，但多數(shù)情況下卻簡(jiǎn)單采用抗生素類藥物治療，有時(shí)不能做到有效治療，同時(shí)基層獸醫(yī)臨床中缺少必要的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，不能準(zhǔn)確診斷出致病性的各種病原。

豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是一種以引起仔豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀的高死亡率、高度傳染性的腸道病毒。PEDV屬于套式病毒目冠狀病毒科α冠狀病毒屬的單股正鏈 RNA病毒，基因組長(zhǎng)約2.8kb，由4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(纖突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N)和3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)共同組成，PEDV有G1和G2[5]兩種基因型。PEDV于1971年在英國(guó)報(bào)道暴發(fā)流行，之后在德國(guó)、比利時(shí)、瑞士、韓國(guó)和日本等養(yǎng)豬國(guó)家報(bào)道流行[4,6]。我國(guó)于1976年首次報(bào)道了PEDV的發(fā)生流行，2008—2018年我國(guó)18個(gè)省、市、地區(qū)PEDV感染分析顯示：PEDV的陽(yáng)性率為48.12%，混合感染陽(yáng)性率為19.06%，我國(guó)中部地區(qū)PEDV混合感染率高于其他省市，冬季(12—2月)為PEDV混合感染多發(fā)季節(jié)[7,8]。豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的DNA病毒，其基因組為環(huán)狀單鏈DNA分子，長(zhǎng)度約為1767/8 bp，主要有Rep和Cap兩個(gè)蛋白編碼基因，完成病毒的復(fù)制和基因組組裝等功能[9,10]，血清型分為PCV1和PCV2，PCV1型無(wú)致病性，PCV2型是主要毒株，可引起仔豬呼吸困難、皮膚蒼白、消瘦腹瀉等臨床癥狀，并引起多種繼發(fā)感染癥狀，稱為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，也可使病豬出現(xiàn)免疫抑制，導(dǎo)致其他病原繼發(fā)感染[9,11]。

本研究通過(guò)病豬臨床癥狀和解剖病變情況，初步認(rèn)為由病毒感染所致，是否有其他病原如PCV2、豬偽狂犬病毒、豬藍(lán)耳病病毒和豬瘟病毒混合感染無(wú)法準(zhǔn)確判斷。故進(jìn)行仔豬腹瀉樣品的PCR分子鑒定，確診病原，針對(duì)病原采用合理有效的救治預(yù)防，為有效防治仔豬腹瀉提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

青海省互助縣某村散養(yǎng)戶從同一養(yǎng)殖場(chǎng)同一時(shí)間購(gòu)進(jìn)一批仔豬飼養(yǎng)，購(gòu)進(jìn)3d后豬群普遍發(fā)生腹瀉并出現(xiàn)死亡病例，采集腹瀉糞便樣品4份保存于冰盒后及時(shí)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.2 主要試劑儀器

本次試驗(yàn)所用試劑如下：糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328)和病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(DP315)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×TransStart PCR SuperMix(AS111)試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AE301)和Trans2K? DNA Marker(BM101)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；其他均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)試劑。本次試驗(yàn)所用的主要儀器包括PCR儀、Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、微量移液器等。

1.3 分子鑒定

利用天根糞便基因組DNA提取試劑盒對(duì)糞樣進(jìn)行基因組DNA的提取，具體的操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，基因組DNA于-20℃中保存?zhèn)溆?。同時(shí)，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒中提供的操作手冊(cè)，提取糞樣中的總RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。病原鑒定用特異性引物見(jiàn)表1。以提取的基因組DNA/cDNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50.0μL)如下：PCR SuperMix 25.0μL，上下游引物(濃度10.0μM)各2.0μL，模板DNA 3.0μL，補(bǔ)充水18.0μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、退火40s，溫度見(jiàn)表1，72℃延伸1～2min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳(電壓120V，時(shí)間35min)，電泳完成后在凝膠成像儀中觀察結(jié)果并拍照。

1.4 基因序列比較與進(jìn)化分析

PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序委托金唯智生物科技有限公司完成，采用Sanger法進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)測(cè)序峰圖分析校正后，在GenBank上采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法進(jìn)行同源序列搜索比對(duì)，應(yīng)用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件進(jìn)行核苷酸序列同源性的分析。利用MEGA 5.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，選擇Kimura 2 parameter模式，進(jìn)行重復(fù)2000次的自舉檢驗(yàn)，從遺傳進(jìn)化角度分析不同地區(qū)的病毒、細(xì)菌和蟲(chóng)株的親緣關(guān)系及其進(jìn)化特點(diǎn)。

表1 PCR分子生物學(xué)鑒定所用引物

2 結(jié)果

2.1 分子鑒定結(jié)果

基于大腸桿菌16S rRNA 基因和沙門(mén)氏菌invA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均未擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的片段；基于細(xì)菌通用引物擴(kuò)增出1500bp的目的片段(如圖1A)，經(jīng)過(guò)測(cè)序BLAST比對(duì)分析后均為環(huán)境菌，非致病性細(xì)菌；基于隱孢子蟲(chóng)18SrRNA 基因、賈第鞭毛蟲(chóng)β-giardin 基因和球蟲(chóng)屬I(mǎi)TS-1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均未擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的片段；基于豬流行性腹瀉病毒N基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增出約750bp的目的片段(如圖1B)，測(cè)序分析均為PEDV(PEDV-QHHZ1)；基于豬圓環(huán)病毒2型Cap基因克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出約700bp的目的片段(如圖1C)，測(cè)序分析均為PCV-2型(PCV2-QHHZ1)；其他病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均未擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的片段。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

2.2 基因同源性分析

測(cè)序后在GenBank上采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/)在線軟件進(jìn)行核苷酸序列同源性的分析，擴(kuò)增測(cè)序的PEDV-QHHZ1的N基因與參考序列黑龍江HM2017株、吉林CH/JLDH/2016株同源性高達(dá)99.47%，與其他株的同源性也都在97.47%以上。擴(kuò)增測(cè)序的PCV2-QHHZ1的cap基因與參考序列河北Tsh2014株的同源性高達(dá)99.72%，與其他株的同源性也都在99.43%以上。

2.3 基因進(jìn)化樹(shù)分析

分別對(duì)PEDV的N基因和PCV的cap基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，本研究鑒定的PEDV-QHHZ1與黑龍江HM2017株、吉林CH/JLDH/2016株親緣關(guān)系較近，聚成一支(如圖2)；本研究鑒定的PCV2-QHHZ1與河北Tsh2014株和美國(guó)39869-NC-201507株親緣關(guān)系較近，聚成一小分支，明顯區(qū)分于PCV1和PCV3，僅與PCV2聚成一大支(如圖3)。

圖2 基于PEDV的N基因的進(jìn)化樹(shù)分析(黑點(diǎn)代表本研究鑒定分離株序列)

圖3 基于PCV的cap基因的進(jìn)化樹(shù)分析(黑點(diǎn)代表本研究鑒定分離株序列)

3 討論

在非洲豬瘟疫情發(fā)生的情況下市場(chǎng)中仔豬數(shù)量在下降，價(jià)格卻在上漲，仔豬的健康狀況對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。但是，仔豬腹瀉已成為養(yǎng)豬業(yè)中重要的常見(jiàn)病，也是導(dǎo)致仔豬死亡的最主要的原因之一。本研究為了快速診斷仔豬腹瀉病原，做出預(yù)防治療方案，特進(jìn)行仔豬腹瀉相關(guān)病原的分子鑒定。

通過(guò)對(duì)腹瀉相關(guān)細(xì)菌病原和寄生蟲(chóng)病原的分子鑒定后，結(jié)果均為陰性，基本排除這兩類病原。在病毒病原的分子檢測(cè)中，PEDV和PCV2這兩種病毒病原為陽(yáng)性。仔豬感染PEDV后主要引起腹瀉、嘔吐等臨床癥狀，PCV2主要引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，同時(shí)可造成免疫抑制，臨床上亦可表現(xiàn)為腹瀉癥狀[11]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室分子鑒定診斷結(jié)果可判斷，導(dǎo)致該村引進(jìn)仔豬發(fā)病的主要原因是PEDV和PCV2混合感染。在青海省境內(nèi)，PEDV的流行資料較少，僅有80年代的文獻(xiàn)報(bào)道PED在樂(lè)都縣、民和縣、互助縣、平安縣、湟中縣、湟源縣和西寧市(含大通)地區(qū)的發(fā)病率為25.0%，死亡率占18%，其中仔豬發(fā)病率占80%[12]。近期，PCV2在青海貴德地區(qū)的感染調(diào)查顯示，PCV2抗體檢測(cè)的平均陽(yáng)性率為95.89%，PCV2病毒核酸檢測(cè)的陽(yáng)性率為100%[13]?？梢?jiàn)，對(duì)這兩種病原的流行病學(xué)調(diào)查資料較少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PCV2存在普遍感染現(xiàn)象。PCV2在仔豬中常表現(xiàn)隱性感染，引起一定的免疫抑制，仔豬處于亞健康狀態(tài)，容易引起其他病原的繼發(fā)感染。本群仔豬同時(shí)感染PEDV，這種病原的混合感染導(dǎo)致的疫病臨床癥狀更加復(fù)雜，在基層很容易造成漏診或誤診，延誤疫病的預(yù)防治療，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

所以，在面對(duì)仔豬群混合感染了PEDV和PCV2時(shí)，對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行有效隔離，對(duì)病死豬撲殺無(wú)害化處理，同時(shí)進(jìn)行緊急免疫接種疫苗。平時(shí)加強(qiáng)仔豬飼養(yǎng)管理，做好飼養(yǎng)環(huán)境改善，勤除糞、多消毒、講衛(wèi)生，減少豬群的應(yīng)激影響因素(溫度、濕度、氨氣濃度)。提高豬群的飼料營(yíng)養(yǎng)水平，使用有效的藥物預(yù)防方案。利用實(shí)驗(yàn)室分子鑒定診斷技術(shù)準(zhǔn)確確定引起仔豬發(fā)病的病因，然后采取相應(yīng)的緊急措施，降低疫病發(fā)生流行概率，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。