張恩會(huì)，于曉涵,2，達(dá)永慶，趙艷萍，萬(wàn)國(guó)安，徐澤馨，陳水紅

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；2.西南大學(xué)生物技術(shù)中心，重慶400700)

禾草內(nèi)生真菌指在宿主禾草體內(nèi)完成全部或部分生活史不表現(xiàn)外部癥狀的真菌[1]。20世紀(jì)80年代初,人們對(duì)內(nèi)生真菌與宿主的共生關(guān)系研究才真正受到重視[2]。禾草—內(nèi)生真菌共生體的雙重特性已經(jīng)成為近30年來(lái)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。關(guān)于禾本科內(nèi)生真菌提高宿主植物生長(zhǎng)和抗性的研究較多。如南志標(biāo)等[1]研究表明布頓大麥內(nèi)生真菌的入侵能增強(qiáng)植株的生長(zhǎng)和分蘗能力。有研究表明，內(nèi)生真菌有利于提高宿主的耐鹽性[3，4]、耐重金屬性[5]、抗蟲(chóng)[6]、抗病[7]、耐旱[8]等特性，進(jìn)一步提高禾草競(jìng)爭(zhēng)性[9]、維持生態(tài)系統(tǒng)[10，11]等功能。關(guān)于禾草內(nèi)生真菌生物學(xué)和生理特征的研究表明，菌株對(duì)碳源和氮源的利用能力存在較大差異[12]，在不同培養(yǎng)基滲透勢(shì)下的生物量[13]、生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢特性也存在差異[14]。布頓大麥(HordeumbogdaniiWilensky)分布于中國(guó)青海、新疆、甘肅等地。一般散生在灘地、河谷等類(lèi)型的草地上，形成茂盛的株叢[15]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，能促進(jìn)幼畜發(fā)育，提高母畜受胎率，是家畜增膘、提高成活率的良好飼草[15,16]。前期研究發(fā)現(xiàn)該草耐鹽堿性較強(qiáng)，在新疆可獲得高產(chǎn),對(duì)于改良鹽堿地有重大意義[17]。課題組前期研究得出內(nèi)生真菌在鹽堿脅迫下具有促進(jìn)布頓大麥生長(zhǎng)的有益作用，且明顯改善宿主耐鹽堿的生理指標(biāo)[18,19]，而對(duì)其內(nèi)生真菌的具體生物學(xué)和生理學(xué)特性還是未知。因此，本試驗(yàn)對(duì)分離自新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣的布頓大麥內(nèi)生真菌WS1的生物學(xué)、生理學(xué)特征進(jìn)行了研究，旨在更好的鑒定新疆布頓大麥內(nèi)生真菌不同生理?xiàng)l件下的差異性，為布頓大麥共生體創(chuàng)新種質(zhì)資源，選育優(yōu)良抗逆牧草新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來(lái)源 2018年6月采于新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣，取完整植株和種子，檢測(cè)是否帶有內(nèi)生真菌。檢測(cè)方法分別用以下兩種：莖髓檢測(cè)法，取植株葉鞘部位用解剖刀斜向剖開(kāi),刮取少許髓質(zhì),加入0.8%乳酸苯胺藍(lán)染液染色,靜置片刻,光鏡下檢測(cè)內(nèi)生真菌菌絲,統(tǒng)計(jì)內(nèi)生真菌帶菌情況；種子檢測(cè)法，在室溫條件下(15℃～22℃)將種子置于5%氫氧化鈉溶液過(guò)夜,第2d用蒸餾水沖洗種子數(shù)次以去除種子表面的氫氧化鈉,然后將種子置于有苯胺藍(lán)溶液的培養(yǎng)皿中靜置2h,鏡檢前將種子外稃去除。將種子放置到載玻片上,用蓋玻片輕按使種子糊粉層和種皮分離,在40倍目鏡下觀察內(nèi)生真菌菌絲，如果種皮或糊粉層中出現(xiàn)大量的深藍(lán)色菌絲,就認(rèn)為該種禾草感染內(nèi)生真菌,每種禾草種子檢測(cè)量為20粒。

1.1.2培養(yǎng)基 分離、純化內(nèi)生真菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基；生理學(xué)測(cè)定培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基、 碳源培養(yǎng)基、氮源培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基；生物學(xué)測(cè)定培養(yǎng)基為布頓大麥粉瓊脂培養(yǎng)基(HMA)、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基(OMA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)、海水營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離和純化 根據(jù)李春杰(2008)[20]的方法分離和純化布頓大麥內(nèi)生真菌。具體操作為將帶菌布頓大麥的莖稈用自來(lái)水沖洗后切成小段，依次用75%乙醇?xì)⒕?0～40s，2%的次氯酸鈉漂洗3～5min，無(wú)菌水漂洗4次后置于PDA平板上于24℃黑暗培養(yǎng)，約1～2周后莖稈切口長(zhǎng)出內(nèi)生真菌菌落。挑取菌落菌絲進(jìn)行培養(yǎng)，待內(nèi)生真菌產(chǎn)孢后，挑取單個(gè)孢子進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2內(nèi)生真菌DNA提取方法 使用真菌DNA提取試劑盒(D3195-01,OMEGA公司)提取本研究所分離純化的內(nèi)生真菌DNA。

1.2.3內(nèi)生真菌管家基因tefA和tubB的PCR擴(kuò)增和測(cè)序 提取內(nèi)生真菌全基因組后，參照Moon等的文獻(xiàn)[21]，分別用tefA(5'-GGGTAAGGAC GAAAAGACTCA，3'-CGGCAGCGATAATCAGGA TAG),tubB(5'-GAGAAAATGCGTGAGATTGT，3'-GTTTCGTCCGAGTTCTCGAC)2對(duì)引物對(duì)內(nèi)生真菌基因組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL體系：12.5μL 2×Taq MasterMix mix(包含1.0U Taq DNA聚合酶，1.5mM MgCl2，200mM各dNTP)，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，8.5μL ddH2O以及2μL DNA模板(40ng/μL)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，(94℃變性30s，tefA55℃、tubB54℃退火30s，72℃延伸1min)，以上括號(hào)中的步驟共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托北京睿博興科生物公司測(cè)序(ABI 3730xl DNA analyser)。

1.2.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.2.4.1不同pH值培養(yǎng)基 用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值為5、7、9和11，于25℃黑暗培養(yǎng)。

1.2.4.2碳源和氮源培養(yǎng)基 碳源處理為在基本培養(yǎng)基里加入KNO32g，再分別加入不同的碳化合物各20 g。氮源處理為基本培養(yǎng)基里加入葡萄糖20g，再分別加入不同的氮化合物2g。

1.2.4.3內(nèi)生真菌生長(zhǎng)與產(chǎn)孢量測(cè)定方法 每周用十字交叉法測(cè)量一次菌落直徑，連續(xù)測(cè)量4周。第6周隨機(jī)選取8個(gè)重復(fù)用體視生物顯微鏡(尼康Ci-l)測(cè)定菌絲、分生孢子梗、分生孢子的大小，并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量。

1.2.5WS1菌株分類(lèi)鑒定

1.2.5.1形態(tài)學(xué)鑒定 觀測(cè)PDA培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)速度、大小、菌落紋飾、質(zhì)地、邊緣、分生孢子大小、孢子梗長(zhǎng)短和產(chǎn)孢量等，進(jìn)行初步分類(lèi)。

1.2.5.2分子鑒定 提取純化菌株WS1的DNA，用基因tefA和tubB引物擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，回收片段連接于PMD18-T載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α。每個(gè)樣本選擇3～5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI用Blast n比對(duì),下載相似性高的內(nèi)生真菌代表性序列，用MEGA 10.1.7處理序列和鄰接法(NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，輸入最佳模型參數(shù)，采用1000次的隨機(jī)重復(fù)取樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 布頓大麥內(nèi)生真菌WS1在不同碳源中的生長(zhǎng)情況

不同碳源中的菌落正面均呈白色，菌落近圓形，背面呈褐色。其中，除基本培養(yǎng)基、淀粉和乳糖碳源中菌絲較稀疏外，其余供試碳源中菌絲都很致密。在菊糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖等碳源的菌落呈現(xiàn)不規(guī)則凸起，而基本培養(yǎng)基和淀粉碳源中菌落較為平坦。除了葡萄糖、甘露醇、蔗糖和果糖碳源中無(wú)菌絲徒長(zhǎng)現(xiàn)象外，其余供試碳源中均有徒長(zhǎng)現(xiàn)象。從表1結(jié)果得出菌落直徑的排序?yàn)椋旱矸?甘露醇>蔗糖>山梨醇>乳糖>麥芽糖>果糖>葡萄糖>菊糖>基本碳源。該真菌在供試9種碳源上的菌落直徑均大于基本培養(yǎng)基，除葡萄糖和菊糖外，其余都顯著高于基本培養(yǎng)基(P<0.05)。各種碳源培養(yǎng)基中孢子長(zhǎng)寬范圍分別為0.024～0.045mm，0.021～0.045mm；孢子梗長(zhǎng)寬范圍分別為0.054～0.1855mm，0.017～0.031mm。乳糖碳源中孢子長(zhǎng)寬最長(zhǎng)(P<0.05)，其產(chǎn)孢量也是最多，在淀粉碳源培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)孢。

表1 9種碳源培養(yǎng)基中WS1第六周的孢子、孢子梗直徑、菌落直徑、產(chǎn)孢特性

2.2 布頓大麥內(nèi)生真菌WS1在不同氮源中的生長(zhǎng)情況

在不同氮源中該菌菌落顏色為白色，菌落圓形，菌絲濃密，背面呈乳白色，中央棕黃。在蛋白胨、胰蛋白胨和酵母提取物氮源中菌落外周出現(xiàn)圈暈。L-脯氨酸和L-亮氨酸氮源中無(wú)菌絲徒長(zhǎng)現(xiàn)象。由表2可以看出添加氮源后菌落直徑均顯著高于對(duì)照基本氮源的菌落直徑，說(shuō)明該菌能夠利用5種供試氮源，其中酵母提取物和脯氨酸菌落直徑最大。氮源培養(yǎng)基中孢子長(zhǎng)寬范圍為：0.029～0.035mm，0.024～0.050mm；孢子梗長(zhǎng)寬范圍為：0.129～0.255mm，0.027～0.032mm，其產(chǎn)孢量顯示此內(nèi)生真菌在胰蛋白胨和酵母提取物為氮源時(shí)產(chǎn)孢量較多。

表2 5種氮源培養(yǎng)基中WS1的孢子、孢子梗直徑、菌落直徑、產(chǎn)孢特性

2.3 布頓大麥內(nèi)生真菌WS1在不同pH中的生長(zhǎng)情況

菌落生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3所示，在pH 5～11 的范圍均落均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，在pH7和pH9的PDA培養(yǎng)基中此真菌菌落直徑最大(P<0.05)，因此pH 7～9范圍為其最適pH。孢子長(zhǎng)寬范圍分別為：0.044～0.050mm,0.026～0.030mm；孢子梗長(zhǎng)寬范圍分別為：0.171～0.256mm，0.022～0.024mm。pH11其產(chǎn)孢量最多(表3)。

表3 不同pH梯度培養(yǎng)基中WS1第六周的孢子、孢子梗直徑、菌落直徑、產(chǎn)孢特性

2.4 布頓大麥內(nèi)生真菌WS1在不同生物學(xué)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

WS1菌株在5種培養(yǎng)基內(nèi)均能夠生長(zhǎng)，菌絲白色，近圓形，但只有布頓大麥草粉培養(yǎng)基內(nèi)的菌落菌絲均勻致密，其他4種均有菌絲徒長(zhǎng)現(xiàn)象。由表4可知，該菌在5個(gè)生物學(xué)培養(yǎng)基的菌落直徑依次為：燕麥粉培養(yǎng)基>海水培養(yǎng)基>PDA培養(yǎng)基>布頓大麥草粉培養(yǎng)基>水瓊脂培養(yǎng)基。孢子長(zhǎng)寬范圍為0.047～0.052mm,0.023～0.028mm；孢子梗長(zhǎng)寬范圍為：0.156～0.205mm，0.021～0.025mm。其產(chǎn)孢量顯示其在宿主布頓大麥草粉培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最多。

表4 不同生物學(xué)培養(yǎng)基中WS1第六周的孢子、孢子梗直徑、菌落直徑、產(chǎn)孢特性

2.5 WS1分類(lèi)鑒定結(jié)果

用苯胺藍(lán)對(duì)布頓大麥植株葉鞘染色，顯微鏡下可見(jiàn)藍(lán)色菌絲(圖1a)即為帶菌植株，用帶菌植株莖稈分離內(nèi)生真菌，獲得純化菌株WS1(圖1b)。WS1生長(zhǎng)緩慢，25℃黑暗條件下培養(yǎng)6周菌落直約4cm左右，菌落呈圓形，中間突出四周平展，絨氈狀，顏色呈白色，菌絲白色，有隔。分生孢子白色至淺黃色，近短圓柱形或球狀，表面不具疣，無(wú)隔膜，孢子生于分生孢子梗的頂端，大小為0.022～0.028mm×0.019～0.023mm。分生孢子梗呈白色，直立，大小0.105～0.207mm×0.0145～0.0185mm(圖1c)。可見(jiàn)，分離的內(nèi)生真菌具備生長(zhǎng)速度較慢、菌落正面白色、分生孢子著生在分生孢子梗頂端等特性，符合Epichloё 屬內(nèi)生真菌菌落的基本特征，初步確定分離所得內(nèi)生真菌為Epichloё屬內(nèi)生真菌。

圖1 WS1菌株的菌絲、菌落及孢子圖

對(duì)菌株WS1用轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子tef引物擴(kuò)增獲得一條805bp的基因序列，經(jīng)序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示菌株WS1的tef序列與Neotyphodiumsp.和Epichloёbromicola的tef序列同源性分別為99.87%和98.32%?；趖ef序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，菌株WS1以84%的支持率與Neotyphodiumsp.和Epichloёbromicola聚在一大支上(圖2)。此外，采用微管蛋白tub為引物進(jìn)行DNA序列擴(kuò)增，獲得一條922 bp基因序列，序列比對(duì)分析結(jié)果表明，菌株WS1的DNA序列與登錄號(hào)分別為KX219728、KP877325的E.bromicola、Epichloё sp.DNA序列同源性分別為99.88%和99.78%，基于tub序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖3所示，菌株WS1與E.bromicola、Epichloё sp.聚在一個(gè)分支上。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將菌株WS1鑒定為Epichloёbromicola。

3 結(jié)論與討論

據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)布頓大麥植株的耐鹽堿性與其所帶的內(nèi)生真菌相關(guān)[3,4]，因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)分離自新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣的這株布頓大麥內(nèi)生真菌WS1進(jìn)了生物學(xué)與生理學(xué)特征研究。結(jié)果表明，布頓大麥內(nèi)生真菌WS1對(duì)不同的碳源利用能力不同,9種供試碳源中此真菌能很好的利用淀粉、甘露醇、蔗糖，其次為山梨醇、乳糖、麥芽糖、果糖，供試碳源中內(nèi)生真菌生長(zhǎng)速度均高于基本培養(yǎng)基，這與目前報(bào)道的醉馬草禾草內(nèi)生真菌利用碳源能力：蔗糖>葡萄糖>乳糖>山梨醇>菊糖>麥芽糖>甘露醇>淀粉>果糖有差異[20]，與陳泰祥等[22]研究甘肅臨澤的野大麥內(nèi)生真菌吸收能力最強(qiáng)的碳源是麥芽糖也不同。這說(shuō)明禾草內(nèi)生真菌，由于其宿主不同、地域氣候差異，其生物學(xué)特性存在差異。

WS1可利用供試的5種氮源，被試氮源中，該內(nèi)生真菌能更好利用脯氨酸和酵母提取物，與以下研究結(jié)果相似：醉馬草內(nèi)生真菌和中華羊茅內(nèi)生真菌最適氮源分別是酵母膏[20]和酵母浸液[14]，高羊茅內(nèi)生真菌最適氮源是L-脯氨酸[20]。本實(shí)驗(yàn)得出胰蛋白胨做氮源時(shí)產(chǎn)孢量較好，這與陳泰祥等[22]對(duì)甘肅臨澤野大麥內(nèi)生真菌WBE1的研究結(jié)果吻合。此真菌在無(wú)氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上也可緩慢生長(zhǎng)，6周后菌落直徑達(dá)到2.73cm，說(shuō)明該菌株有較發(fā)達(dá)的氮代謝途徑，此結(jié)果與陳泰祥等的結(jié)論一致。

WS1在pH 5～11均可生長(zhǎng)說(shuō)明其對(duì)酸堿性的適應(yīng)能力良好，但在pH11的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度慢，菌絲出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，其最適生長(zhǎng)的pH范圍為7～9，結(jié)果與金文進(jìn)等[14]研究中華羊茅內(nèi)生真菌其適宜的pH是7～9的結(jié)果一致，與野大麥內(nèi)生真菌WBE1的最適pH范圍為5.09～6.10不相符合，推測(cè)該菌生長(zhǎng)在中性偏堿性環(huán)境與宿主布頓大麥適應(yīng)鹽堿環(huán)境有關(guān)，真菌長(zhǎng)期與宿主共生，受植物長(zhǎng)期生活的鹽堿自然生態(tài)環(huán)境影響，它也適應(yīng)了鹽堿環(huán)境，因而其最適pH偏堿性。

在燕麥粉培養(yǎng)基(OMA)、海水培養(yǎng)基(SNA)、PDA培養(yǎng)基、布頓大麥草粉培養(yǎng)基(HMA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)5種生物培養(yǎng)基中，該菌都可以生長(zhǎng)。其中在OMA和SNA上的菌落最大，OMA培養(yǎng)基中有豐富的纖維素為菌株的生長(zhǎng)提供碳源，這與陳泰祥等[22]的研究結(jié)果相似，在SNA中生長(zhǎng)最快，也再一次驗(yàn)證了此菌適應(yīng)中性偏堿性環(huán)境。

本研究對(duì)分離自新疆阿克蘇溫宿縣的布頓大麥內(nèi)生真菌WS1進(jìn)行了生物學(xué)和生理學(xué)特性研究，并對(duì)此菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子鑒定。得到該菌對(duì)不同碳氮源的利用存在差異，淀粉碳源中菌落長(zhǎng)的最快，乳糖碳源中孢子長(zhǎng)寬最長(zhǎng)，產(chǎn)孢量最多；在酵母提取物和脯氨酸氮源上長(zhǎng)勢(shì)最好；生長(zhǎng)的最適pH為7-9；在OMA和SNA上生長(zhǎng)最快，HMA上產(chǎn)孢最多；分類(lèi)鑒定結(jié)果表明WS1屬于Epichloёbromicola。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為布頓大麥共生體創(chuàng)新了種質(zhì)資源、選育優(yōu)良抗逆牧草新品種奠定基礎(chǔ)。