侯爽爽，吳蔓莉，肖賀月，段旭紅，易寧

（陜西省環(huán)境工程重點實驗室，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室，西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，西安 710055）

生物刺激修復(fù)是目前廣為采用的土壤有機污染修復(fù)技術(shù)[1-2]。石油污染土壤中由于外碳源的大量輸入，造成氮磷營養(yǎng)相對缺乏，制約了土著微生物的代謝活性及其對石油烴的降解能力。向土壤中補充氮磷營養(yǎng)或添加調(diào)理劑是一種常用的生物刺激修復(fù)方式[3-6]。一些研究對加入外源氮修復(fù)石油污染土壤進行了詳細報道[7-9]。所采用的氮源包括無機氮源NH4Cl、KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和有機氮源尿素 CO（NH2）2等多種類型[10-13]。研究認為，當土壤C/N/P 接近100/10/1 時，土壤微生物活性最好，對石油烴的去除能力最強[14]。

微生物修復(fù)對石油烴的去除效果不僅與土壤pH值、濕度、養(yǎng)分、土壤微生物活性和數(shù)量有關(guān)，還與土壤污染時長有關(guān)[15]。一些研究認為新污染土壤中存在的大量輕質(zhì)烴具有較好的生物可利用性，容易被土壤微生物降解代謝。然而，也有研究認為在新污染土壤中，降解菌數(shù)量少且活性低，石油污染使得土壤土著微生物處于“擾動期”，菌群結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定降低了石油烴的生物去除效率[16-18]。陳舊性污染土壤中存在的穩(wěn)定菌群和數(shù)量較多的功能降解菌有利于石油烴的去除，但老化石油烴可能會被土壤有機質(zhì)吸附鎖定，導(dǎo)致其生物可利用性變差[19-21]。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，向陜北采油區(qū)污染土壤中加入有機肥可有效去除土壤中的石油烴。通過對比幾種無機氮源發(fā)現(xiàn)，KNO3對污染土壤中石油烴的去除有較好的促進作用。脫硫石膏作為常用的土壤調(diào)理劑，可以調(diào)節(jié)土壤pH 值并改善土壤的持水性[22-23]。因此本文選取上述3 種物質(zhì)作為生物刺激劑，比較施入有機肥、KNO3、脫硫石膏對不同污染時長土壤的修復(fù)效果，同時對土壤微生態(tài)變化情況進行研究，結(jié)果可為明確土壤受到污染后的最佳修復(fù)時期及影響因素提供一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 石油污染土壤

在陜北子長某油井附近取受石油污染5 a以上的表層黃綿土（0～20 cm），并在附近取潔凈的未受污染土壤（土壤中石油烴背景值低于500 mg·kg-1），密封儲存于聚乙烯袋中帶回實驗室。兩種土樣分別經(jīng)風(fēng)干、除雜、破碎、過2 mm篩混勻后備用。石油污染黃綿土的土壤質(zhì)地和主要理化性質(zhì)如表1所示。

新污染土壤的制備：向6.5 kg 潔凈土壤中加入130 g 原油，原油取自陜北子長油田區(qū)，原油中總烴含量為81.24%，瀝青和膠質(zhì)含量低于1%，其他非烴化合物含量約為17.76%，石油烴組分的測定方法為柱層析法[24]和氣相色譜法[25]（對16 種多環(huán)芳烴進行測定）。將土壤與原油利用滅菌鏟攪拌混勻，自然條件下放置7 d后進行修復(fù)處理，土壤中總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴的含量分別為16 847、13 067 mg·kg-1和2 000 mg·kg-1。

陳舊性污染土壤：稱取6.5 kg 從陜北子長采集的陳舊性污染土壤，土壤中總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴的含量分別為17 746、12 667 mg·kg-1和3 567 mg·kg-1。

表1 石油污染黃綿土的基本理化性質(zhì)及土壤質(zhì)地Table 1 Physicochemical properties and soil textures of oil contaminated loessal soil

1.2 修復(fù)方案

分別利用有機肥（取自西北農(nóng)林科技大學(xué)，以干質(zhì)量比1∶2 的豬糞∶稻殼并加入5.0%的木炭渣經(jīng)堆制腐解而成，基本性質(zhì)[26]見表 2）、KNO3、脫硫石膏（GYP，取自西安熱電陽光熱力有限公司，理化性質(zhì)見表3）作為生物刺激劑對新污染和陳舊性污染土壤進行連續(xù)150 d 修復(fù)，具體修復(fù)方案如表4 所示。每個處理3 個平行。定期向土壤中加入滅菌純水以保持土壤含水率為15%，每3 d翻動一次進行通氧。

分別于修復(fù)的第 15、30、45、60、90、120、150 d 取樣，對土壤中的石油烴含量、pH 值、微生物數(shù)量及微生物活性進行測定。

1.3 分析測定方法

1.3.1 石油烴的提取和測定

利用超聲波萃取土壤中的總石油烴并用質(zhì)量法進行測定。稱取5 g 待測土樣置于通風(fēng)櫥風(fēng)干研磨后，準確稱取3.0 g 干土壤于50 mL 離心管內(nèi)，加入10 mL 正己烷和二氯甲烷的等體積混合液，冰浴條件下利用超聲波破碎儀（JY96-ⅡN，寧波新芝生物科技股份有限公司）超聲萃取10 min，功率為180 W。在-4 ℃條件下，以8 000 r·min-1的速度離心15 min，過濾，收集濾液于稱質(zhì)量后的30 mL 稱量瓶內(nèi)，重復(fù)上述操作兩次，每次加入10 mL 提取劑，合并濾液，將稱量瓶置于通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干至恒質(zhì)量[27]。

1.3.2 土壤微生物數(shù)量的測定

采用稀釋平板法[28]對土壤中的微生物數(shù)量進行測定，主要測定步驟如下：

土壤中微生物的提?。号渲谱銐蛄康臒o機鹽液體培養(yǎng)基（Na2HPO4·H2O 17.689 g，KH2PO43.0 g，NH4Cl 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO41 mL 1 mol·L-1，微量元素 2.5 mL，純水1 000 mL）于錐形瓶中，將錐形瓶用封口膜封住，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在121 ℃、103.4 kPa條件下滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，準確稱取1.0 g 土壤放入離心管內(nèi)，加入9.0 mL 滅菌的無機鹽培養(yǎng)基，渦旋振蕩1 min 后，靜置20 min，潷析獲得上清液即為土壤中的微生物懸液。

土壤中微生物數(shù)量的測定：配制適量的LB 固體培養(yǎng)基（NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，純水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加18 g 瓊脂，pH 值為7.0）于錐形瓶中，按上述方法滅菌30 min。滅菌完成后，在無菌條件下將冷卻至60 ℃左右的LB 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻待用。

將上述潷析獲得土壤微生物懸液在10 mL 離心管中進行梯度稀釋（稀釋至10-4～10-7），吸取100 μL的稀釋液于培養(yǎng)皿中，在酒精燈附近用涂布棒進行涂布。將涂布好的培養(yǎng)皿倒置在30 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中48 h 后，選取菌落數(shù)在30～300 之間的平板進行計數(shù)。

1.3.3 降解菌活性測定

利用原油、3 種多環(huán)芳烴混合物（菲1 g、蒽0.1 g、芘0.1 g，用二氯甲烷溶解并定容至100 mL）作為兩種自定義碳源。利用Biolog-MT2 板對石油烴降解菌活性進行測定，具體步驟為：準確稱取各取樣周期的干土壤樣品1.0 g 放入含有99.0 mL 滅菌蒸餾水的錐形瓶內(nèi)，振蕩 20 min 并靜置 30 min 后，分別移取 150 μL上清液接種到MT2 微孔板中，分別在每個微孔中加入5 μL 原油和多環(huán)芳烴作為自定義碳源，以不添加任何碳源的A1～H4 微孔為對照。將接種好的MT2 板放入恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）中培養(yǎng)168 h，每24 h 記錄一次數(shù)據(jù)，并記錄微孔的平均顏色變化率（Average well color development，AWCD），AWCD計算公式如下：

表2 有機肥的基本性質(zhì)（mg·kg-1）Table 2 Selected chemical characteristics of the organic fertilizer（mg·kg-1）

表3 脫硫石膏的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of desulfurized gypsum

表4 石油污染土壤生物刺激修復(fù)方案Table 4 Experiment design for biostimulation of oil contaminated soil

式中：Ci為第i個反應(yīng)孔的光度值，Rj為第j個對照孔的光度值。

1.3.4 土壤pH值的測定

向50 mL離心管中加入10 g待測土樣及25 mL無二氧化碳蒸餾水，磁力攪拌1 min 后，靜置30 min，澄清后利用校準過的pH 計（PHS-3CT，上海雷磁）進行測定。

1.4 降解動力學(xué)研究

利用零級、一級、偽一級、二級動力學(xué)方程對石油烴降解隨時間變化情況進行擬合，相關(guān)系數(shù)最大者為反應(yīng)的降解動力學(xué)模型。降解動力學(xué)方程如下：

零級降解動力學(xué)方程：

一級降解動力學(xué)方程：

二級降解動力學(xué)方程：

式中：ct為隨時間變化的污染物濃度，mg·kg-1；c0為污染物初始濃度，mg·kg-1；k為零級降解動力學(xué)速率常數(shù)；t為降解時間，d；k1為一級降解速率常數(shù)，d-1；k2為二級降解速率常數(shù)，d-1。

對于石油烴降解率隨時間的變化可參考偽一級動力學(xué)方程：

式中：y為石油烴降解率，%；a為由非線性回歸曲線求得的常數(shù)；t為修復(fù)時間，d；k′為反應(yīng)速率常數(shù)，d-1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 18.0 軟件對石油烴降解率、pH 值、微生物數(shù)量及硝氮、氨氮的測定結(jié)果進行相關(guān)性分析[29-30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中石油烴的去除效果

新污染土壤（污染7 d）和陳舊性污染土壤（污染5 a以上）中石油烴的去除效果如圖1所示。

新污染土壤中石油烴初始含量為16 847 mg·kg-1。經(jīng)150 d的修復(fù)處理，CK、Y、Y+N、GYP 處理中的石油烴含量分別變?yōu)?2 646、6 716、7 398、10 882 mg·kg-1，石油烴降解率分別為24.94%、60.13%、56.09%、35.40%。加入有機肥和有機肥與硝酸鉀混合物對新污染土壤中石油烴的去除效果較好（圖1a）。

加入生物刺激劑對陳舊性污染土壤中石油烴的去除效果如圖1b 所示。經(jīng)過150 d 的修復(fù)，Y、GYP、Y+N 處理中石油烴含量由17 746 mg·kg-1分別降低至11 248、11 249、12 797 mg·kg-1，石油烴去除率分別為36.62%、36.61%、27.88%。對于陳舊性污染土壤，加入有機肥或脫硫石膏對土壤中石油烴的去除效果較好。

2.2 石油烴生物降解的動力學(xué)特征

分別利用零級、一級、偽一級、二級動力學(xué)方程對石油烴降解隨時間變化的趨勢進行擬合，擬合參數(shù)見表5和表6。

根據(jù)表5 和表6 可知，新污染和陳舊性污染土壤中石油烴的生物降解均符合偽一級動力學(xué)方程。利用偽一級動力學(xué)方程對石油烴降解率隨時間變化趨勢進行擬合，得到圖2。根據(jù)圖2可知，不同修復(fù)處理的土壤中石油烴生物降解隨時間變化均符合偽一級動力學(xué)方程，相關(guān)系數(shù)R2在0.9以上。

2.3 生物刺激修復(fù)對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響

2.3.1 土壤pH值

圖3 為修復(fù)過程中土壤pH 值的變化曲線。相比CK 土壤，經(jīng)生物刺激修復(fù)處理的土壤pH 值明顯降低，土壤 pH 值由 8.50～8.56 降低至 7.35～7.91。pH 值接近中性時土壤微生物活性最大，pH 值過高或過低都會抑制微生物的生長。本研究中的污染土壤為堿性土，加入生物刺激劑降低了土壤的pH值，為土著微生物的生長和代謝活性提供了有利條件。

2.3.2 土壤微生物數(shù)量

土壤微生物數(shù)量變化見圖4。對新污染土壤修復(fù)150 d，CK、Y、Y+N 和GYP 4 種處理中的微生物數(shù)量分別為4.7×104、8.1×106、6.9×106、5.2×105cfu·g-1土（圖4a）。經(jīng)CK、Y、Y+N 和GYP 處理的陳舊性污染土壤中微生物數(shù)量分別為 5.3×104、8.6×106、1.3×107、4.0×105cfu·g-1土（圖4b）。Y 和Y+N 修復(fù)的土壤中微生物數(shù)量最多，比CK 和GYP 處理的土壤中高出約2個數(shù)量級。因此，向不同污染時長土壤中加入有機肥可促進土壤微生物的增殖，且陳舊性污染土壤中微生物數(shù)量略多于新污染土壤。

表5 新污染土壤中石油烴降解的動力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters of petroleum hydrocarbon biodegradation in the freshly contaminated soil

表6 陳舊性污染土壤中石油烴降解的動力學(xué)參數(shù)Table 6 Kinetic parameters of petroleum hydrocarbon biodegradation in the aged contaminated soil

2.3.3 降解菌的代謝活性

以石油烴和多環(huán)芳烴為自定義碳源，利用Biolog法測定了新污染土壤和陳舊性污染土壤中石油烴和多環(huán)芳烴降解菌的代謝活性，測定結(jié)果如圖5所示。

以石油烴為唯一碳源時，新污染和陳舊性污染土壤的 AWCD 值范圍分別為 0.08～0.51 和 0.06～0.49。不同污染時長土壤中微生物對石油烴的代謝活性相差較小。新污染土壤分別在CK 和Y 修復(fù)30 d和45 d時，土壤微生物對石油烴的代謝活性最大，此后逐漸降低。陳舊性污染土壤均在Y 和Y+N 修復(fù)15 d 時，土壤微生物的代謝活性最大，此后活性隨培養(yǎng)時間的增加而逐漸降低。

以多環(huán)芳烴為唯一碳源時，新污染和陳舊性污染土壤的 AWCD 值分別為 0.01～0.11 和 0.01～0.27。陳舊性污染土壤中微生物對多環(huán)芳烴的代謝活性總體大于新污染土壤。經(jīng)過120 d 的修復(fù)，新污染土壤中Y 處理對多環(huán)芳烴的代謝活性最大，CK 和Y+N 處理次之，GYP 處理中微生物對多環(huán)芳烴的代謝活性最低；陳舊性污染土壤中微生物對多環(huán)芳烴的代謝活性由高到低順序為Y＞Y+N＞CK＞GYP，與新污染土壤趨勢基本一致。結(jié)果表明，加入脫硫石膏修復(fù)處理的土壤中微生物對多環(huán)芳烴的代謝活性最差。

2.4 石油烴降解與硝氮、氨氮、pH 值及微生物數(shù)量的相關(guān)性分析

對石油烴降解率、pH 值、微生物數(shù)量及硝氮、氨氮進行相關(guān)性分析所得的結(jié)果如表7所示。

由表7 可知，對污染時長不同的土壤，影響石油烴降解的關(guān)鍵因素不同。新污染土壤中的石油烴降解率與硝氮、pH 值、微生物數(shù)量呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.686、-0.789、0.849（P＜0.01），與氨氮的相關(guān)性不顯著。陳舊性污染土壤中石油烴降解率與土壤pH 值呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.683（P＜0.01），與微生物數(shù)量及氮素含量無顯著相關(guān)關(guān)系。

表7 石油污染土壤生物刺激處理的各項指標相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of biological stimulation treatments of petroleum contaminated soil

3 討論

向污染土壤中施入有機肥進行修復(fù)處理是一種環(huán)保經(jīng)濟的修復(fù)方法。有研究表明，向Cd 和Pb 污染的稻田土壤施用生物有機肥可以提高土壤pH值以及土壤養(yǎng)分含量，并顯著降低土壤有效態(tài)Cd 和Pb 的含量[31]。Wellman 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，對于石油烴濃度為5 000 mg·kg-1的污染土壤，施加有機肥修復(fù)41 d后，石油烴去除率高出對照組49%。本研究中，相比脫硫石膏，施入有機肥對不同污染時長土壤中的石油烴均有較好的去除效果。

有機肥中含有較高的有機質(zhì)和豐富的養(yǎng)分，向污染土壤中施入有機肥，可為土壤土著微生物提供豐富的養(yǎng)分。此外，有機肥的保水、保溫和透氣性能可為微生物的生長增殖提供有利的環(huán)境條件。本研究中，向不同污染時長的土壤中施入有機肥進行修復(fù)處理，顯著提高了土壤中微生物數(shù)量和代謝活性，進而提高了土壤中石油烴的去除效率。

生物刺激修復(fù)對新污染土壤中石油烴的去除效率高于陳舊性污染土壤，不同污染時長土壤中影響石油烴降解的關(guān)鍵因素存在差異。影響新污染土壤中石油烴降解效率的主要因素包括土壤硝氮含量和微生物數(shù)量?？赡苁怯捎谠谛挛廴就寥乐?，進入土壤中的石油烴使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，土壤土著菌群處于“擾動期”，此時向土壤中補充養(yǎng)分或者增加土壤微生物數(shù)量均可提高降解菌對石油烴的代謝活性。

陳舊性污染土壤中石油烴降解與微生物數(shù)量及氮素含量無顯著相關(guān)關(guān)系。一些研究認為[33-35]，影響陳舊性污染土壤中石油烴降解的主要因素是土壤有機質(zhì)對石油烴的吸附鎖定。陳舊性污染土壤中的石油烴經(jīng)過長時間的遷移轉(zhuǎn)化，會緩慢進入有機質(zhì)中的玻璃態(tài)剛性區(qū)域，污染物一旦進入介質(zhì)孔隙內(nèi)部，很難被微生物接觸利用，一部分污染物形成結(jié)合殘留態(tài)而直接被鎖定，幾乎不能被降解。

4 結(jié)論

（1）向石油污染黃綿土中加入有機肥可提高土壤微生物數(shù)量和活性，進而促進土壤中石油烴的去除。加入有機肥修復(fù)150 d，對新污染與陳舊性污染土壤中的總石油烴去除率分別為60.13%和36.62%。不同污染時長的土壤中石油烴的生物降解均符合偽一級動力學(xué)。

（2）新污染土壤中石油烴的去除效率與降解菌數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，影響新污染土壤中石油烴降解的關(guān)鍵因素為土壤中降解菌數(shù)量和硝氮含量。陳舊性污染土壤中的石油烴降解率與微生物數(shù)量及氮含量無顯著相關(guān)關(guān)系。生物刺激修復(fù)處理使不同污染時長的土壤pH 值降低，為微生物的生長和活性提高提供了有利的環(huán)境條件。