沈文靜，張瀟，趙子昂，方再光，謝曦，王蓉，胡文婷*

（1.海南大學生命科學與藥學院，熱帶生物資源教育部重點實驗室，?？?570228；2.海南大學海洋學院，?？?570228）

農藥對環(huán)境與生物的污染已經引起了我國政府的高度重視，《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則》專門針對化學農藥對于水體中魚類的毒性風險評估作出了統(tǒng)一規(guī)范。斑馬魚（Brachydanio rerio）具有發(fā)育快、繁殖周期短、易培養(yǎng)和方便操作等優(yōu)點，因此常用作化學農藥環(huán)境安全評價的魚類模式生物[11]。敵草快對生物的毒性是由活性氧（ROS）引起的氧化應激，肝、腎是哺乳動物被損害的主要臟器[1]。肝臟作為魚類重要的代謝器官，具有解毒、免疫等的生理功能，是藥物毒性反應的主要靶器官之一；鰓是魚類呼吸的重要器官，也是水體中污染物首先攻擊的靶器官[12]。本研究以斑馬魚為試驗材料，研究敵草快對斑馬魚的鰓和肝臟組織的損傷作用，并通過測定肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S 轉移酶（GST）的活性，以及丙二醛（MDA）和甘油三酯（TG）含量評估敵草快對斑馬魚肝臟的損害作用，旨在揭示敵草快對環(huán)境生物尤其是魚類的毒性作用機制，為今后深入研究敵草快的水生生態(tài)毒理效應以及環(huán)境生物對敵草快的解毒機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

挑選健康、成熟、平均體長為（3.5±0.5）cm 的斑馬魚，水溫（25±2）℃，pH 為 6.8～7.8，溶解氧＞6 mg·L-1，室內馴養(yǎng) 1 周。

1.1.2 主要試劑

200 g·L-1敵草快水劑，購于山東三農生物科技有限公司；SOD 測試盒、GST測試盒、MDA 測試盒、TG測試盒購于南京建成生物工程研究所；總蛋白定量測試盒購于上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性和暴露試驗

綜合來看，行政事業(yè)單位內部控制制度的完善與優(yōu)化具有顯著的現(xiàn)實意義，本文從內部控制環(huán)境、財務人員素質與法律法規(guī)等各個方面展開了針對性研究，結合人員風險意識的建立，對未來的工作進行了必要指導與借鑒。隨著未來控制環(huán)境的改變，行政事業(yè)的財務管理水平也需要與時俱進，才能在經濟活動中更好地發(fā)揮引導作用，保障企業(yè)未來的可持續(xù)發(fā)展。

根據(jù)預試驗，確定在敵草快中暴露96 h 的最高LC0為 3 mg·L-1，24 h 最低 LC100為 40 mg·L-1。按等對數(shù)間距法，設定各組的敵草快濃度分別為39.09、20.58、10.83、5.17、3.00 mg·L-1，并設置空白對照組，每組3 個重復，隨機選取10 尾斑馬魚放入3 L 試驗用液中。采用靜態(tài)試驗法，試驗前24 h 停止喂食，試驗期間禁食，記錄各試驗組中斑馬魚的臨床癥狀以及死亡情況，并及時撈出死魚。統(tǒng)計 24、48、72 h 和 96 h 的斑馬魚存活數(shù)量，利用Probit 模型計算得到半致死濃度（LC50）和安全質量濃度（SC）。以96 h LC50的1/2、1/4、1/10 設置敵草快處理組，同時設置空白對照組，每組10 尾斑馬魚，方法同上。96 h 后從每組存活的斑馬魚中隨機取3尾，解剖收集鰓、肝臟組織。

1.2.2 慢性暴露試驗

分別以96 h LC50的1/10、1/20、1/50作為敵草快暴露濃度，并設置空白對照，各組養(yǎng)殖30 尾斑馬魚作為試驗魚放入20 L 試驗用液中，采用半靜態(tài)試驗法，每24 h更換1/3的試驗用液，試驗期間每日喂食兩次，投食總質量不超過魚體總質量的3%。分別在7、14 d和28 d 取8 尾斑馬魚的肝臟組織，漂洗后用濾紙拭干，按魚組織質量（g）：生理鹽水（mL）為1∶9 加入預冷的生理鹽水進行勻漿，在4 ℃、2 500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液備用。

1.2.3 組織切片與觀察

組織塊用4%多聚甲醛固定48 h，經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，樹脂封片，顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4 肝臟酶學和生化指標檢測

采用上海碧云天生物的BCA 蛋白濃度試劑盒測定總蛋白含量。SOD、MDA、GST、TG的測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，WST-1 法測定SOD 活性，比色法測定 GST 活性，TBA 法測定 MDA 含量，GPO-PAP法測定TG的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)用Excel 2007處理作圖，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 敵草快對斑馬魚的急性毒性

暴露于39.09、20.58 mg·L-1敵草快中的斑馬魚最初出現(xiàn)無規(guī)則快速游動，隨后部分試魚長時間浮于水表面，口舒張，鰓部擴張、體色變深，隨著處理時間的延長，魚體出現(xiàn)失衡、側翻游動，最終喪失游動能力；暴露于10.83、5.17 mg·L-1敵草快中的斑馬魚最初出現(xiàn)快速泳動現(xiàn)象，后期未出現(xiàn)其他明顯癥狀；暴露于3.00 mg·L-1敵草快中的斑馬魚在處理過程中未出現(xiàn)明顯的不良癥狀。中毒死亡個體體色發(fā)暗、胸鰭張開、鰓絲暗紅、體表有黏液。利用SPSS 19.0軟件中的Probit 模型統(tǒng)計得到敵草快對斑馬魚24、48、72、96 h的LC50分別為27.85、21.36、17.95、16.92 mg·L-1，敵草快安全質量濃度為1.69 mg·L-（1SC=96 h LC50×0.1）。

2.2 敵草快對斑馬魚鰓和肝臟的形態(tài)損傷

斑馬魚暴露于8.46、4.23 mg·L-1和1.69 mg·L-1濃度敵草快中96 h后，分別取空白對照組和各處理組斑馬魚的鰓和肝臟組織進行切片分析。

鰓組織切片觀察結果顯示（圖1、表1）：空白對照組斑馬魚鰓的組織結構完整，呼吸上皮細胞排列整齊、規(guī)則，緊貼在鰓小片表面（圖1A）；在1.69 mg·L-1的敵草快溶液中暴露96 h后，斑馬魚鰓組織中的鰓小片呼吸上皮細胞發(fā)生水腫浮離，排列不規(guī)則，并且出現(xiàn)部分脫落（圖1B）；在4.23 mg·L-1的敵草快中暴露后，鰓小片上皮細胞腫脹、大量脫落或黏滯于鰓小片間，鰓小片末端膨大，損傷加重（圖1C）；8.46 mg·L-1的敵草快暴露則造成了鰓小片卷曲、萎縮，鰓絲組織細胞解離、空泡化，基部細胞增生，呼吸上皮與毛細血管分離嚴重，形成空腔（圖1D）。

肝組織切片觀察結果顯示（圖2、表2）：空白對照組斑馬魚肝細胞分布均勻，連接緊密呈網狀，細胞結構完整，細胞邊界清晰，細胞核圓且位于中央（圖2A）；當斑馬魚暴露在1.69 mg·L-1敵草快水溶液中96 h 后，肝臟部分細胞核偏移，細胞腫大，出現(xiàn)空泡（圖2B）；暴露在4.23 mg·L-1敵草快中的斑馬魚其肝細胞腫脹，部分肝細胞破裂，細胞輪廓不清晰，核仁模糊或解體（圖2C）；暴露在8.46 mg·L-1的敵草快96 h 后，斑馬魚肝臟組織結構紊亂，肝細胞嚴重變形，出現(xiàn)大量無核肝細胞，炎性反應明顯，伴有細胞壞死、溶解現(xiàn)象（圖2D）。

2.3 敵草快對肝臟SOD活性的影響

斑馬魚在1.69、0.84、0.34 mg·L-1的敵草快中暴露后，各處理組肝臟的SOD 活性呈現(xiàn)降-升-降的趨勢（圖3）。暴露7 d，各處理組斑馬魚肝臟的SOD 活性降低，且隨敵草快濃度的增大，活性下降更明顯，其中濃度為0.84 mg·L-1和1.69 mg·L-1處理組與空白對照組存在極顯著差異（P＜0.01）；暴露14 d，各處理組斑馬魚肝臟的SOD 活性升高，其中濃度為0.34 mg·L-1和0.84 mg·L-1處理組的SOD 活性與空白對照組相比存在顯著差異（P＜0.05），濃度為1.69 mg·L-1處理組與空白對照組存在極顯著差異（P＜0.01）；暴露28 d 時，各處理組斑馬魚肝臟的SOD 活性下降，與空白對照組之間均無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 敵草快對肝臟GST活性的影響

敵草快對斑馬魚肝臟的GST 活性影響如圖4 所示。在敵草快28 d 的持續(xù)暴露過程中，濃度為0.84 mg·L-1和 1.69 mg·L-1處理組斑馬魚肝臟的 GST 活性在第7 d 出現(xiàn)增強，7～28 d 的暴露過程中活性持續(xù)降低；暴露28 d 后，濃度為0.84 mg·L-1處理組斑馬魚肝臟GST 活性顯著低于空白對照組（P＜0.05），濃度為1.69 mg·L-1處理組極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。濃度為0.34 mg·L-1處理組斑馬魚肝臟的GST 在暴露過程中活性變化不顯著（P＞0.05）。

2.5 敵草快對肝臟MDA含量的影響

敵草快對斑馬魚肝臟MDA 含量影響如圖5 所示。暴露7 d，各處理組斑馬魚肝臟MDA 含量與空白對照組相比無明顯變化；暴露14 d，各處理組斑馬魚肝臟MDA 含量均受到敵草快暴露的輕微誘導，但與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）；暴露28 d，濃度為 0.84 mg·L-1和 1.69 mg·L-1的處理組 MDA 含量與空白對照組相比極顯著升高（P＜0.01）。

表1 急性敵草快脅迫對斑馬魚鰓組織結構的影響Table 1 Acute effect of diquat exposure on histopathology of gill in zebrafish

表2 急性敵草快脅迫對斑馬魚肝組織結構的影響Table 2 Acute effect of diquat exposure on histopathology of liver in zebrafish

2.6 敵草快對肝臟TG含量的影響

敵草快對斑馬魚肝臟TG 含量的影響見圖6。暴露7 d，各處理組斑馬魚肝臟TG 未表現(xiàn)出明顯的改變，暴露14 d，各處理組斑馬魚肝臟TG 與空白對照組相比均出現(xiàn)上升，濃度為0.34 mg·L-1和0.84 mg·L-1的處理組與空白對照組之間有顯著性差異（P＜0.05），暴露28 d，各處理組斑馬魚肝臟TG 含量仍高于對照組，濃度為0.84 mg·L-1和1.69 mg·L-1的處理組顯著大于空白對照組（P＜0.05），濃度為0.34 mg·L-1的處理組與空白對照組差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 敵草快對斑馬魚的急性毒性效應

半致死濃度通常可以反映物質的毒性程度，常被作為急性毒性試驗的重要檢測指標[13]。本研究的結果發(fā)現(xiàn)敵草快對斑馬魚96 h LC50為16.92 mg·L-1，與成云峰等[14]的研究結果基本一致（96 h LC50=17.5 mg·L-1）。根據(jù)化學物質對魚類急性毒性分級標準[13]，敵草快對斑馬魚的毒性分級屬于中等毒性。敵草快對魚類的急性毒性較高，毒性的差異與魚類的種類、所處發(fā)育階段、代謝能力有密切關系，斑馬魚對敵草快的耐受力略高于肖龍等[10]報道的中華鳑鲏魚（Rhodeus sinensisGünther）對敵草快的耐受力。

3.2 敵草快對斑馬魚鰓和肝組織結構的急性損傷作用

急性損傷試驗可以為敵草快脅迫的應激反應評估提供依據(jù)，選擇的敵草快最高劑量濃度為96 h LC50的1/2，在試驗過程中2 尾斑馬魚死亡，該濃度的敵草快可以對斑馬魚造成明顯的毒性作用；最低劑量濃度為急性毒性試驗得到的安全濃度1.69 mg·L-1[15-16]，該濃度接近敵草快的田間施用濃度[17]。

鰓是魚類進行氣體交換的器官，在排氨和參與滲透壓調節(jié)、維持離子穩(wěn)態(tài)中有重要作用，其組織結構易遭受水環(huán)境中污染物的破壞[18]。有研究表明，輕度的呼吸上皮水腫和細胞增生在不破壞鰓正常功能的情況下，可以阻擋外界污染物進入內部組織，避免造成進一步的損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：低濃度的敵草快處理，斑馬魚鰓小片呼吸上皮出現(xiàn)水腫浮離、細胞增生，表明低濃度條件下，會誘導斑馬魚出現(xiàn)應激防御反應；隨著敵草快濃度的增加，斑馬魚鰓組織結構損傷加重，鰓小片呼吸上皮細胞出現(xiàn)壞死、脫落、毛細血管擴張、破裂、空泡化和空腔等嚴重的損傷現(xiàn)象，與百草枯對大蓋巨脂鯉（Colossoma macropomum）和藍線鰭魚（Trichogaster trichopterus）鰓組織的損傷結果相一致[19-20]。作為百草枯的同類除草劑，敵草快進入呼吸上皮細胞和毛細血管壁細胞，在細胞內誘導產生大量的活性氧自由基，導致產生防御反應，阻礙鰓細胞的正常氣體交換，隨著濃度的增加，防御平衡被打破，組織結構被破壞，嚴重影響鰓的正常生理功能，引起魚類死亡。

對哺乳動物的研究表明，百草枯主要導致肺損傷和肺組織纖維化，而敵草快主要損害的臟器是肝和腎，其肝臟代謝產物的毒性進一步增強[1，21]。肝臟是魚類解毒的主要器官，魚類在污染的水體中肝臟組織會發(fā)生結構和生理變化[22]。已有研究發(fā)現(xiàn)，有毒物質會引起魚類肝細胞線粒體腫脹，活性氧自由基增加，導致脂質過氧化，破壞細胞膜系統(tǒng)的結構和功能，使細胞出現(xiàn)空泡化[23]。本研究中，短時間暴露在低濃度敵草快中的斑馬魚肝細胞出現(xiàn)腫大和空泡化，表明敵草快誘導肝臟產生了氧化應激，肝功能可能受到了影響；當敵草快濃度增加時，肝臟組織損傷更明顯，空泡化嚴重、細胞界限模糊，并引起肝細胞溶解，說明細胞膜系統(tǒng)遭受了破壞，肝功能已經受到了影響，肝組織細胞變形、核仁消失的現(xiàn)象也是細胞壞死的先兆；最終當敵草快達到一定濃度時，肝細胞出現(xiàn)明顯的壞死現(xiàn)象，使肝臟失去正常功能，導致魚類死亡[18]。

3.3 敵草快對斑馬魚肝臟的慢性損害

肝臟是脊椎動物體內最大的腺體，對糖類代謝、脂類代謝、解毒等生命活動起著非常重要的作用。魚類的肝臟和哺乳動物肝臟一樣，是魚類物質代謝以及解毒的重要場所。由于魚類自身棲息的環(huán)境相對其他動物更為獨特，環(huán)境水體中有毒有害物質更容易使肝臟遭受損傷，從而影響其正常的生理與代謝功能。隨著人類生產生活中除草劑的普遍使用，越來越多的研究證明除草劑類有毒物質已經嚴重威脅到環(huán)境生物尤其是水生魚類的健康與安全，且對魚類的肝臟產生直接毒害作用。肝細胞SOD 和GST 的活性以及MDA 和TG 的含量，是評估肝臟在有毒環(huán)境條件下受損傷程度的重要指標[24-25]。為了研究長期接觸敵草快對斑馬魚肝臟的損害作用，本研究選擇96 h LC50的1/10、1/20 和1/50 作為暴露濃度，考察了以上指標的變化，敵草快最低劑量濃度為0.34 mg·L-1，相當于農田中噴灑敵草快后的環(huán)境濃度[17]。

氧化應激是敵草快對人類和其他哺乳動物肝臟功能損傷與毒性作用的基礎，敵草快通過誘導細胞發(fā)生氧化應激反應引起肝細胞抗氧化酶活力的改變，損傷程度取決于暴露時間和濃度[26]。已有研究報道，敵草快可誘導斑馬魚胚胎氧化應激產生過量的超氧陰離子等活性氧自由基[21]。當體內活性氧自由基超過抗氧化體系的清除能力時，會對肝臟細胞產生毒性作用，影響抗氧化酶活性。SOD 具有清除超氧陰離子能力，是維持機體內活性氧動態(tài)平衡的重要抗氧化酶，其活力直接反映了機體清除氧自由基的能力[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，敵草快處理14 d 時，肝細胞中SOD 活性增加，表明低濃度的超氧陰離子會誘導該酶的活性，但隨著體內超氧陰離子的積累，并達到肝組織損傷的閾值時，會破壞肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)。因此，敵草快處理28 d 時，該酶的活性出現(xiàn)下降，表明肝臟抗氧化系統(tǒng)的功能受到了影響。

GST 具有抗氧化酶和Ⅱ相代謝酶的雙重功能，催化還原性谷胱甘肽與內源性和外源性親電子化學物反應，不僅可以與其他抗氧化酶在細胞內共同起到緩解氧化應激的作用，而且可以幫助細胞解毒[28]。另外，當肝細胞受損害時，GST 易于通過肝細胞膜而被釋放到血液中，是檢測肝臟受損的敏感性指標[29]。在高濃度敵草快處理初期，斑馬魚肝組織中GST活性被誘導，可能是該酶表現(xiàn)出的應激反應，以幫助機體緩解敵草快的毒性作用。Sanchez 等[30]的研究表明，222 μg·L-1和 444 μg·L-1的敵草快誘導也同樣使三刺魚（Gasterosteus aculeatus）肝臟中GST 的活性增加。隨著細胞內活性氧和有毒物質的累積，GST的活性出現(xiàn)下降，并隨時間延長持續(xù)降低，提示敵草快長期脅迫造成了肝臟氧化還原失衡、解毒能力降低，并且肝細胞可能受到了損害。

MDA 是體內脂質過氧化作用的標志性產物，也被認為是自由基誘導生物膜脂質過氧化反應的直接產物，其含量的變化可間接反映生物受自由基攻擊后膜系統(tǒng)的氧化損傷程度[31]。暴露在聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯等農藥中的魚類，其肝臟組織中MDA 含量顯著增加[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，敵草快處理28 d 時，斑馬魚肝細胞中MDA 含量極顯著增加。表明敵草快引起斑馬魚肝細胞內自由基增多，肝脂質過氧化水平升高，這可能是造成細胞膜通透性改變、細胞輪廓模糊的原因之一。

肝是機體TG 代謝的主要器官，與脂肪組織共同調控能量代謝。一些有毒物質造成動物肝損傷，引發(fā)氧化應激反應，導致脂質代謝異常和肝細胞內TG 增加[22，34]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露在較高濃度敵草快中的斑馬魚肝臟中的TG 含量上升，斑馬魚肝臟脂質代謝受到影響。敵草快暴露造成斑馬魚肝臟細胞的空泡化，活性氧自由基增加導致脂質過氧化破壞細胞膜是細胞空泡化產生的原因之一，另外空泡形成往往與糖脂代謝紊亂有關，TG 在肝臟細胞內沉積，也會形成可以觀察到的空泡[25-26]。

4 結論

（1）急性敵草快脅迫可導致斑馬魚鰓和肝臟組織產生病理學改變，劑量越大，損傷越嚴重。

（2）長期敵草快刺激使斑馬魚肝臟氧化還原狀態(tài)受到破壞，發(fā)生脂質過氧化，肝臟Ⅱ相代謝酶——谷胱甘肽-S 轉移酶的活性降低，并且使肝臟脂質代謝出現(xiàn)障礙。