黃獻(xiàn)培，向壘，郭靜婕，潘一峰，陳逸平，李彥文，莫測輝*

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州 510632；2.汕尾市海洋產(chǎn)業(yè)研究院，廣東 汕尾 516600）

微塑料是指一類粒徑小于5 mm 的塑料微粒，在全球環(huán)境中被大量檢出，其污染及毒性效應(yīng)已成為全球關(guān)注的環(huán)境問題和研究熱點(diǎn)[1-2]。環(huán)境中的塑料垃圾由于風(fēng)力、水流、光照及生物分解等因素裂解形成小于5 mm甚至納米級的微塑料[3]，日常護(hù)理用品中的納米級塑料微球也是環(huán)境中微塑料的主要來源[4-5]，這些微塑料很難分解，可在環(huán)境中存在數(shù)百年至幾千年[6]。微塑料污染會(huì)對生物產(chǎn)生直接毒性效應(yīng)，造成嚴(yán)重的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[7-8]，同時(shí)也會(huì)在生物體內(nèi)積累[9]，并可能通過食物鏈傳遞[10-11]，嚴(yán)重威脅人體健康。目前，微塑料的研究主要集中在海洋、河口和沙灘等水域環(huán)境以及對水生生物的生態(tài)毒性[6，12-14]，發(fā)現(xiàn)不同粒徑的微塑料對水生生物毒性存在顯著差異[14-16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)微塑料能夠降低土壤的微生物生物量、活性及功能多樣性，從而影響土壤中營養(yǎng)元素的地球化學(xué)循環(huán)，進(jìn)而影響植物種子的萌發(fā)及幼苗生長[17-18]。但有關(guān)微塑料對陸地及農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)影響的研究仍相對薄弱[2，19]，對陸地高等植物特別是蔬菜作物的直接毒性研究相對較少[9，20]，有關(guān)微塑料對植物潛在毒性，特別是不同粒徑微塑料對作物的毒性效應(yīng)亟待進(jìn)行深入的研究[21]。

蔬菜是人類重要的膳食食品，有關(guān)微塑料對葉菜類種子發(fā)芽和幼苗生長等方面的研究迄今鮮見報(bào)道。聚苯乙烯是使用最為廣泛的塑料材料，被大量用于塑料杯、塑料薄膜等包裝盒及建筑保溫等產(chǎn)業(yè)，占全球年度塑料產(chǎn)量的7.1%[22]，已成為土壤、河流、湖泊和海洋的主要污染物[23]。因此，本文采用葉菜類作物十字花科蔬菜菜心（Brassica campestrisL.）作為供試植物，以3種不同粒徑（0.07、1 μm和20 μm）的聚苯乙烯微球（PS-MPs）為供試污染物，研究不同粒徑PS-MPs在不同濃度下對菜心種子發(fā)芽和幼苗生長的影響，旨在探討微塑料粒徑對蔬菜等農(nóng)作物的毒性效應(yīng)，為評價(jià)微塑料對陸生作物的生態(tài)毒性效應(yīng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料：供試菜心品種為廣泛種植于華南地區(qū)的華冠油青60天粗條菜心王，種子購自深圳喜良種子有限公司，發(fā)芽率為98%。聚苯乙烯微球（PS-MPs）購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心，粒徑分別為0.07、1 μm和20 μm，規(guī)格均為10 mL裝微球懸浮液（去離子水），固含量2.5%（m：V），粒徑及分散特征見圖1。

設(shè)備及試劑：無菌玻璃培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、智能人工氣候箱（MGC-300H，上海一恒）、立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-100SII，上海博迅）、超純水系統(tǒng)（Master-Duv，上海和泰）；超聲波清洗機(jī)（德意生）；30% H2O2溶液（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)用水均為無菌水（超純水滅菌待用）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚苯乙烯懸浮液（污染溶液）制備

將不同體積的PS-MPs 懸浮液（原液）分別加入無菌水中，超聲振蕩5 min，使其均勻分散懸浮于無菌水，形成污染溶液備用，實(shí)驗(yàn)前再次超聲波振蕩5 min，確保PS-MPs充分懸浮分散。

1.2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

將處理濃度為 125、250、500、1 000、2 000、4 000 mg·L-1和 8 000 mg·L-1的 PS-MPs 懸浮液各 2 mL 分別置于內(nèi)徑為9 cm、鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別接入經(jīng)挑選和消毒（10%雙氧水中靜置10 min，無菌水漂洗3 次）的菜心種子各10 粒，以無菌水作為空白對照（CK）。蓋好培養(yǎng)皿并用封口膜密封，置于人工氣候箱中25 ℃避光恒溫培養(yǎng)，種子露白即認(rèn)為其發(fā)芽[24-25]，當(dāng)對照組種子發(fā)芽率大于90%、根長大于20 mm，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。計(jì)算PS-MPs對根伸長、芽伸長及生物量的抑制率為50%和10%的濃度（IC50、IC10），計(jì)算公式為（A-B）/A×100%，其中A為對照處理的根伸長、芽伸長或生物量，mm；B為污染處理的根伸長、芽伸長或生物量，mm。

1.2.3 正式實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在PS-MPs 對菜心種子根伸長和芽伸長抑制率10%～50%范圍內(nèi)，設(shè)置7 個(gè)濃度處理125、250、500、750、1 000、1 500 mg·L-1和2 000 mg·L-1，以無菌水為空白對照（CK），每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，與預(yù)實(shí)驗(yàn)相同條件下進(jìn)行種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測定各處理種子的發(fā)芽率、根伸長、芽伸長（以胚軸與根之間的過渡區(qū)分根伸長和芽伸長[24-25]）和生物量。計(jì)算發(fā)芽率、根伸長、芽伸長和生物量的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS 20 軟件，以濃度-抑制率繪制曲線，進(jìn)行回歸分析，獲得最佳擬合回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算污染物對根伸長、芽伸長和生物量抑制率為10%（IC10）和50%（IC50）的濃度，其中把IC10值作為引起植物受害的閾值（敏感性），其值越小說明污染物越易產(chǎn)生毒害；把IC50值作為評價(jià)污染物毒性大小的關(guān)鍵值，其值越小，毒性越大[26]。

1.2.4 可溶性蛋白和可溶性糖含量、酶活性測定

取發(fā)芽試驗(yàn)終止后的菜心幼苗，按質(zhì)量∶體積（g∶mL）=1∶9的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol·L-1，pH 為 7～7.4），制備 10% 或 1% 組織勻漿液，離心（3 500 r·min-1、10 min）后取上清液，用于檢測菜心幼苗可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化氫酶（CAT）活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力。試驗(yàn)用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，實(shí)驗(yàn)操作方法參照說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 和Excel 對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析、作圖和計(jì)算IC10值、IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PS-MPs對菜心種子發(fā)芽率的影響

表1 PS-MPs對菜心種子發(fā)芽率的影響（%）Table 1 Effects of PS-MPs on seed germination rates of Brassica campestris L.（%）

不同濃度處理下，3 種粒徑PS-MPs對菜心種子發(fā)芽率的影響存在差異（表1）。當(dāng)濃度低于500 mg·L-1時(shí)，各粒徑PS-MPs對菜心種子發(fā)芽率的影響較小，抑制率在10%以內(nèi)。隨著PS-MPs 濃度的增加（＞500 mg·L-1），0.07 μm和20 μm PS-MPs對菜心種子發(fā)芽率的抑制作用隨之上升，其中后者對菜心種子發(fā)芽率抑制作用的IC50值約為1 500 mg·L-1，當(dāng)濃度增大至2 000 mg·L-1時(shí)，菜心種子無法發(fā)芽；前者對菜心發(fā)芽率的 IC50值則大于 2 000 mg·L-1，其在2 000 mg·L-1時(shí)菜心發(fā)芽率為66.7%。此結(jié)果表明，大粒徑PS-MPs對菜心種子發(fā)芽的抑制作用強(qiáng)于小粒徑PS-MPs。與0.07 μm 和 20 μm PS-MPs 不同，1 μm PS-MPs 濃度即使在500～1 000 mg·L-1濃度范圍時(shí)，仍對白菜種子發(fā)芽率影響較小（＜7%）；當(dāng)其濃度提升至1 500 mg·L-1時(shí)，對菜心種子發(fā)芽率的影響顯著增強(qiáng)，抑制率達(dá)46.7%；其濃度進(jìn)一步提高至2 000 mg·L-1時(shí)，菜心種子無法發(fā)芽。結(jié)果表明3 種粒徑的PS-MPs 對菜心種子發(fā)芽率顯著抑制的最低濃度大小順序?yàn)? μm PSMPs（1 500 mg·L-1）＞20 μm PS-MPs（1 000 mg·L-1）＞0.07 μm PS-MPs（500 mg·L-1），即小粒徑（0.07 μm）PS-MPs 最易引起菜心種子發(fā)芽率的抑制作用，但較大粒徑（1 μm和20 μm）產(chǎn)生的毒性作用則較強(qiáng)。

2.2 PS-MPs對菜心種子芽伸長、根伸長和生物量的影響

3種粒徑的PS-MPs對菜心種子根伸長、芽伸長及生物量的毒性存在顯著的差異，結(jié)果如表2和圖2所示。不同粒徑的PS-MPs對菜心種子根伸長、芽伸長及生物量的毒性均呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，且抑制作用均隨著濃度的增加而逐漸提高，呈較好的回歸關(guān)系（圖2），擬合方程的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.869（P＜0.05）（表2）。各指標(biāo)的IC10值最低濃度的大小順序?yàn)椋? μm PS-MPs的芽伸長（165.8 mg·L-1）＞20 μm PS-MPs 的生物量（92.5 mg·L-1）＞0.07 μm PS-MPs 的生物量（11.7 mg·L-1），即 0.07 μm PS-MPs 最易引起菜心種子發(fā)芽的抑制作用。IC50值計(jì)算結(jié)果表明，各粒徑PS-MPs對菜心種子發(fā)芽抑制作用最大的最低濃度大小順序?yàn)椋? μm PS-MPs的根伸長（705.0 mg·L-1）＞ 0.07 μm PS-MPs的生物量（486.0 mg·L-1）＞ 20 μm PS-MPs 的生物量（354.2 mg·L-1），即20 μm PS-MPs對菜心種子發(fā)芽的抑制作用最大。

表2 PS-MPs對菜心種子發(fā)芽的影響Table 2 Effects of PS-MPs on seed germination of Brassica campestris L.

2.3 PS-MPs 對菜心幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

3種粒徑PS-MPs處理下，菜心幼苗中可溶性蛋白和可溶性糖含量特征如圖3（a）和圖3（b）所示，20 μm PS-MPs各濃度處理下，菜心幼苗中可溶性蛋白含量均顯著低于對照組（P＜0.05），而可溶性糖含量與對照組相比無顯著性差異；0.07 μm PS-MPs 處理組中，污染物濃度低于500 mg·L-1時(shí)，菜心幼苗可溶性糖含量高于對照組（P＜0.05），而在750～1 500 mg·L-1時(shí)，可溶性蛋白含量顯著低于對照組（P＜0.05）；1 μm PS-MPs 處理組中，當(dāng)污染物濃度高于750 mg·L-1時(shí)，菜心可溶性蛋白含量均顯著低于對照組（P＜0.05），且隨著PS-MPs濃度的增高而逐漸降低；而可溶性糖含量在各處理濃度下與對照組相比均無顯著差異。

2.4 PS-MPs對菜心幼苗CAT和SOD活性的影響

3 種粒徑PS-MPs 對菜心幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響如圖4所示，菜心幼苗CAT活性整體呈現(xiàn)隨PS-MPs濃度升高而升高的現(xiàn)象，當(dāng)PS-MPs 低濃度時(shí)CAT 活性被抑制效果顯著（P＜0.05）；其中20 μm PS-MPs處理組中，污染物濃度低于500 mg·L-1時(shí)，菜心幼苗中的CAT活性均顯著低于對照組，而 0.07 μm PS-MPs 和 1 μm PS-MPs 處理組中，分別只在低于250 mg·L-1和125 mg·L-1時(shí)才具有顯著性差異（P＜0.05）。與CAT活性變化趨勢截然相反，3 種粒徑PS-MPs 處理下，菜心幼苗的SOD活性整體呈現(xiàn)隨PS-MPs濃度升高而降低的現(xiàn)象；其中0.07 μm PS-MPs 處理組中，污染物濃度在125～250 mg·L-1和1 000～1 500 mg·L-1時(shí)，菜心幼苗中SOD 活性分別顯著高于和低于對照組（P＜0.05）；而1 μm 和 20 μm PS-MPs 處理組中，當(dāng)污染物濃度高于750 mg·L-1時(shí)菜心幼苗中SOD活性均顯著低于對照組（P＜0.05）。

3 討論

本研究表明，PS-MPs暴露對菜心種子發(fā)芽率、根伸長、芽伸長及生物量均有一定的抑制作用。在PSMPs 濃度小于250 mg·L-1時(shí)，菜心種子均能正常發(fā)芽，即較低濃度下，各粒徑的PS-MPs 對菜心種子的正常發(fā)芽影響不顯著（P＞0.05）；當(dāng) 20、1 μm 和 0.07 μm PS-MPs 濃度分別達(dá)到1 000、1 500 mg·L-1和500 mg·L-1時(shí)，菜心種子的發(fā)芽率開始顯著降低（P＜0.05），特別是達(dá)到最高濃度時(shí)（2 000 mg·L-1），20 μm和1 μm PS-MPs處理的菜心種子均不發(fā)芽，該結(jié)果表明菜心種子對不同粒徑的PS-MPs 具有劑量特征效應(yīng)，受到高濃度PS-MPs 污染時(shí)，菜心種子會(huì)完全不發(fā)芽[27]。

IC10值比較發(fā)現(xiàn)，不同粒徑PS-MPs 對菜心種子發(fā)芽毒性作用的敏感性大小順序?yàn)?.07 μm＞20 μm＞1 μm，表明0.07 μm PS-MPs 最易引起菜心種子發(fā)芽毒性效應(yīng)，這可能是因?yàn)榱捷^小的PS-MPs（0.07 μm）可以吸附在水分子中，迅速進(jìn)入植物組織中，阻斷細(xì)胞間的連接，阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，從而迅速地引起細(xì)胞毒性[20,28]；20 μm PS-MPs 引起菜心種子發(fā)芽的敏感性小于0.07 μm PS-MPs而大于1 μm PS-MPs，可能是粒徑較大的PS-MPs（20 μm）團(tuán)聚包裹在種子表面，堵塞植物細(xì)胞壁孔洞，阻礙水分及營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)入，從而抑制菜心種子的發(fā)芽和生長[20,29]；1 μm PSMPs 的發(fā)芽毒性效應(yīng)敏感性最小，可能是該粒徑的PS-MPs（1.0 μm）難以通過菜心根系細(xì)胞間隙的自由空間和質(zhì)外體屏障進(jìn)入根系皮層甚至中柱，又無法在種皮外部形成緊密的“屏障”進(jìn)而極大地阻礙水分等物質(zhì)的進(jìn)入[9]。20、1 μm和0.07 μm PS-MPs對菜心種子根伸長、莖伸長和生物量抑制作用的IC50分別為354.2～630.9、705.0～1 238.1 mg·L-1和 486.0～1 337.7 mg·L-1，表明粒徑較大的PS-MPs（20 μm）對菜心種子發(fā)芽的毒性最大，在較低濃度下即可顯著抑制菜心種子發(fā)芽生長，這與PS-MPs 對小麥生長特性的影響結(jié)果相似，即5 μm PS-MPs 較0.1 μm PS-MPs 對小麥表現(xiàn)出更大的毒性效應(yīng)[30]。

可溶性蛋白和可溶性糖是生物體內(nèi)維持細(xì)胞滲透勢的重要物質(zhì)，其含量變化與外界對生物生長發(fā)育脅迫息息相關(guān)[31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同粒徑PS-MPs處理下，菜心幼苗體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量發(fā)生了明顯的變化，而且，不同粒徑處理下，可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化趨勢也不一致，表明菜心幼苗可以通過調(diào)節(jié)可溶性蛋白和可溶性糖的含量高低來保持其細(xì)胞的滲透勢，從而提高其對不同粒徑PSMPs 的抗脅迫能力，這也體現(xiàn)PS-MPs 對菜心幼苗毒性作用的粒徑效應(yīng)。其作用機(jī)制可能與菜心幼苗對不同粒徑PS-MPs 的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力有關(guān)，有研究表明，亞微米級甚至微米級的塑料顆粒都可以穿透小麥和生菜根系進(jìn)入植物體，并能在蒸騰拉力的作用下通過導(dǎo)管系統(tǒng)隨水流和營養(yǎng)流進(jìn)入作物可食用部位[9,28]。同時(shí)，塑料顆粒本身也具有一定柔韌性，它們可能在受到擠壓力的作用下進(jìn)入到狹小的根部質(zhì)外體空間，進(jìn)一步滲透進(jìn)入根系皮層組織甚至到達(dá)導(dǎo)管組織中，也可以通過新生側(cè)根縫隙而進(jìn)入根部木質(zhì)部導(dǎo)管并進(jìn)一步傳輸?shù)角o葉組織[32]。

CAT 和SOD 活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，它們的值越高，表明受到的脅迫越大[30]。本文研究發(fā)現(xiàn)3 種粒徑PS-MPs 處理時(shí)，除了在0.07 μm PS-MPs 低濃度（≤250 mg·L-1）處理時(shí)菜心體內(nèi)SOD 活性顯著升高外；其他處理中菜心幼苗體內(nèi)CAT 和SOD 活性整體呈現(xiàn)抑制的現(xiàn)象，特別在高濃度處理時(shí)（≥1 000 mg·L-1），SOD 活性均顯著低于對照組，且呈現(xiàn)隨PS-MPs 濃度增高而逐漸降低的趨勢。低濃度處理下酶活性的升高可能是菜心幼苗免受外界脅迫毒害的調(diào)節(jié)反應(yīng)，而高濃度處理下活性顯著下降則表示超出菜心幼苗自身調(diào)節(jié)能力的閾值，酶活力受到嚴(yán)重的損傷[30]。酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明PSMPs對菜心幼苗毒性的機(jī)制涉及氧化應(yīng)激系統(tǒng)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，3 種粒徑（納米級和微米級）PS-MPs暴露對菜心種子發(fā)芽及幼苗生長均產(chǎn)生顯著的毒性效應(yīng)，但不同粒徑和濃度PS-MPs 對菜心產(chǎn)生不同毒性生態(tài)效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究，研究結(jié)果為深入了解微塑料對作物發(fā)芽、幼苗生長的影響提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）PS-MPs 對菜心種子發(fā)芽存在顯著的毒性效應(yīng)，且表現(xiàn)出一定的粒徑效應(yīng)。

（2）不同粒徑PS-MPs 處理對菜心種子根伸長、芽伸長和生物量的影響表現(xiàn)為小粒徑（0.07 μm）對毒性敏感性影響最大，但大粒徑（20 μm）PS-MPs 對毒性影響更大。

（3）菜心幼苗通過調(diào)節(jié)體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量來提高對不同粒徑PS-MPs 的抗脅迫能力。同時(shí)，PS-MPs 對菜心幼苗的毒性影響機(jī)制涉及氧化應(yīng)激系統(tǒng)。