陳 俊，馮 燕，孟祥明

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230601)

1 引 言

線粒體是真核細(xì)胞母系遺傳的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器，是重要的生物能合成工廠[1]。線粒體在細(xì)胞新陳代謝、器官、組織以及整個(gè)生命體內(nèi)包括Ca2+平衡的調(diào)控[2]、清除多余或者破損的細(xì)胞器和觸發(fā)細(xì)胞死亡等方面都起著至關(guān)重要的作用[3-4]。因此，細(xì)胞的存活需要維持正常的線粒體水平。線粒體缺陷或功能障礙與一些心血管和神經(jīng)性疾病等有關(guān)[5-7]。而且線粒體的微環(huán)境與其功能關(guān)系緊密，尤其是pH值直接影響其生化過程。例如線粒體表現(xiàn)出一種略堿性基質(zhì)，穿過內(nèi)膜的質(zhì)子動(dòng)力能驅(qū)動(dòng)ATP合成、離子及代謝物吸收到基質(zhì)中去[8]。由此可見，線粒體動(dòng)態(tài)變化[9]和微環(huán)境[10]的檢測(cè)對(duì)線粒體生物學(xué)及相關(guān)疾病的研究具有重要意義。

到目前為止，已報(bào)道的pH測(cè)定方法包括核磁共振法(NMR)[11]、吸收光譜法[12-13]、表面增強(qiáng)拉曼散射法(SERS)[14-15]、水凝膠[16]等。而基于pH熒光探針的熒光成像方法因能排除其他信號(hào)分子的干擾，對(duì)pH具有特異性響應(yīng)、靈敏度高和實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[17-18]。開發(fā)具有線粒體靶向能力的pH熒光探針將為細(xì)胞線粒體內(nèi)pH波動(dòng)的實(shí)時(shí)成像研究提供有力工具。

基于本課題組利用熒光探針可視化研究細(xì)胞微環(huán)境方面的工作[19-22]，本文以性能優(yōu)異的香豆素[23-25]為熒光團(tuán)設(shè)計(jì)并合成了一種靶向線粒體的pH熒光探針(CMPH)。酚羥基是pH響應(yīng)基團(tuán)，在pH<7的酸性條件下，羥基是較弱的電子供體；在pH>7的堿性條件下，脫質(zhì)子化的O-是較強(qiáng)的供電子基團(tuán)。帶正電荷的苯并噻唑鹽既賦予探針良好的水溶性[26]，又可作為有效的線粒體的靶向基團(tuán)。通過對(duì)光學(xué)性能和細(xì)胞毒性的測(cè)試，表明該探針具有pH特異性和較好的生物相容性。本研究通過對(duì)細(xì)胞共聚焦熒光成像的分析，評(píng)價(jià)了探針CMPH用于活細(xì)胞線粒體pH特異性熒光成像的可行性，旨在為線粒體微環(huán)境的可視化檢測(cè)及相關(guān)疾病的研究提供一種便捷的化學(xué)工具。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 化學(xué)試劑

7-羥基香豆素(阿拉丁試劑有限公司)、吡啶(天津博迪化工有限股份公司)、三氟乙酸(安耐吉化學(xué))、2-甲基苯并噻唑(安耐吉化學(xué))、乙酸乙酯、二甲基亞砜(DMSO)及其他試劑均為市售分析純級(jí)。

2.2 探針CMPH的合成

探針CMPH的合成路線如圖1所示。

圖1 探針CMPH的合成路線Fig.1 Synthetic route of probe CMPH

2.2.1 中間體的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[27]合成Compound 1(7-乙酰氧基香豆素)和Compound 2(7-羥基香豆素-8-醛)、文獻(xiàn)[28]合成Compound 3(3-芐基-2-甲基苯并噻唑溴鹽)。

2.2.2探針CMPH的合成

精準(zhǔn)地稱取一定量的Compound 2(0.53 g，2.8 mmol)和Compound 3(0.897 g，2.8 mmol)加入史萊克瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入乙醇(10 mL)和哌啶(3滴)，70 ℃下反應(yīng)8 h，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，抽濾，乙醚洗滌3次，收集得到墨綠色固體CMPH 1.18 g，收率為86%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ10.52(s,1H) 8.41(d,J=15.3 Hz,2H),8.31(d,J=15.0 Hz,2H),7.92(d,J=10.5 Hz,1H),7.81(t,J=7.6 Hz,1H),7.73(t,J=7.4 Hz,1H),7.59(s,1H),7.39～7.33(m,5H),6.79(s,1H),6.23(s,1H),6.02(s,2H);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ172.4,160.8,154.9,149.5,143.5,141.0,134.5,133.4,132.4,130.7,129.7,129.0,128.6,126.6,125.7,122.9,118.2,115.2,113.4,113.2,108.1,58.5。ESI-MS:m/z412.099 9([M-Br]+,calcd 412.100 2)。

2.3 光譜測(cè)試

探針CMPH母液配制：稱取一定量的CMPH溶于DMSO，配制成濃度為2 mmol/L的備用儲(chǔ)備液，0 ℃保存。移液槍精準(zhǔn)移取15 μL探針母液，加入不同pH的PBS緩沖溶液配成濃度為10 μmol/L的測(cè)試液，測(cè)試探針的紫外和熒光光譜。

2.4 干擾性測(cè)試

在pH=7.4的條件下，向CMPH(10 μmol/L)中加入各分析物(50 μmol/L)。30 min后，激發(fā)波長選擇380 nm，測(cè)試加入各分析物后溶液熒光強(qiáng)度的變化。

2.5 細(xì)胞共聚焦熒光成像

在37 ℃、5% CO2的濕化氣氛下，將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素(100 μg/mL)、1%鏈霉素(100 μg/mL)的Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)培養(yǎng)基中。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞移至含有10 μmol/L CMPH和0.5 μmol/L商業(yè)化染料(Mito-Tracker Green)的DMEM培養(yǎng)基中孵育45 min，用PBS緩沖液洗滌3次。細(xì)胞熒光成像在共聚焦顯微鏡(Leica TCS DIVE/SP8 DIVE)上進(jìn)行，獲得標(biāo)記細(xì)胞的熒光顯微鏡圖像。利用Image J進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)采集和處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針的光學(xué)性質(zhì)

分別測(cè)試了在不同pH(5.0，6.0，6.5，6.8，7.0，7.5，7.8，8.0，9.0，10.0)的PBS緩沖溶液中CMPH(10 μmol/L)的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。如圖2(a)所示，探針在380 nm處顯示出最大吸收峰，當(dāng)pH值從5.0增加到10.0時(shí)，探針CMPH最大吸收峰的峰值也伴隨著pH的增大而升高。如圖2(b)所示，探針CMPH在380 nm激發(fā)光的照射下，在460 nm左右顯現(xiàn)出最大發(fā)射峰，探針的斯托克斯位移為80 nm左右，證明該探針具有背景干擾低的優(yōu)點(diǎn)。隨著pH值的增大，探針的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。如圖2(c)所示，我們對(duì)不同pH下探針的熒光強(qiáng)度進(jìn)行擬合，得出探針的pKa=7.79。如圖2(d)所示，探針在pH值為6.5～8.2范圍內(nèi)的響應(yīng)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.99。

圖2 探針在不同pH條件下的光學(xué)性質(zhì)。(a)紫外吸收光譜；(b)熒光發(fā)射光譜(λex=380 nm)；(c)探針的熒光強(qiáng)度隨pH波動(dòng)的趨勢(shì)圖；(d)探針的熒光強(qiáng)度與pH的線性關(guān)系。Fig.2 Optical properties of the probe tested under different pH conditions.(a)Absorption spectra.(b)Emission spectra(λex=380 nm).(c)Trend diagram of fluorescence intensity of probe fluctuating with pH.(d)Linear relationship between fluorescence intensity of CMPH and pH.

3.2 干擾性實(shí)驗(yàn)

眾所周知，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境是由許多不同的生物分子和離子組成的。為了證實(shí)CMPH能夠有效地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中的pH值，在pH=7.4的PBS緩沖液中測(cè)試了CMPH在一些陰陽離子和生物信號(hào)分子存在下的熒光強(qiáng)度。從圖3可以看出，探針在分別加入相應(yīng)的離子和信號(hào)分子后，幾乎都沒有觀察到明顯的熒光變化，說明CMPH對(duì)pH的檢測(cè)具有較高的選擇性。此外，由于羥基的質(zhì)子化/脫質(zhì)子化的可逆性，我們分別在pH=5.0和pH=8.0的PBS緩沖液中對(duì)探針進(jìn)行了循環(huán)8次的熒光測(cè)試。如圖4所示，CMPH在PBS緩沖溶液中表現(xiàn)出極好的可逆性。

圖3 探針CMPH的干擾性測(cè)試(F：探針加入離子或生物成分后的熒光強(qiáng)度；F0：探針的熒光強(qiáng)度)Fig.3 Interference test of probe CMPH(F:fluorescence intensity of probe with adding ions or biological species，F(xiàn)0:fluorescence intensity of probe)

圖4 探針CMPH在pH=5.0和pH=8.0時(shí)的可逆性測(cè)試Fig.4 Reversibility test of probe CMPH at pH=5.0 and pH=8.0

良好的水溶性和穩(wěn)定性是探針進(jìn)行生物應(yīng)用的前提。在pH=7.4的PBS緩沖液中測(cè)試了CMPH在不同時(shí)間段熒光強(qiáng)度的變化，如圖5所示，探針在24 h內(nèi)并無明顯的熒光強(qiáng)度變化。同時(shí)，在測(cè)試過程中并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的探針絮狀沉淀，表明該探針具有良好的水溶性和穩(wěn)定性。

圖5 不同時(shí)間段探針熒光強(qiáng)度的變化Fig.5 Changes of probe’s fluorescence intensities in different time periods

3.3 細(xì)胞毒性

為了評(píng)價(jià)探針CMPH是否適合細(xì)胞成像，我們用MTT法[29]測(cè)試了CMPH的細(xì)胞毒性。即使在使用了20 μmol/L的 CMPH處理HeLa細(xì)胞24 h的情況下，仍有88%左右的細(xì)胞保持細(xì)胞活力，如圖6所示。結(jié)果表明，CMPH具有較低的細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞損傷較小，可以進(jìn)行細(xì)胞成像。

圖6 細(xì)胞毒性測(cè)試Fig.6 Cytotoxicity test

3.4 活細(xì)胞線粒體共定位熒光成像

為了評(píng)估探針能否用于活細(xì)胞線粒體pH變化的特異性檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了熒光共聚焦成像。選取HeLa細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)行線粒體共定位實(shí)驗(yàn)。用含有CMPH(10 μmol/L)和商業(yè)染料Mito-Tracker Green(0.5 μmol/L)的培養(yǎng)基共同孵育HeLa細(xì)胞30 min。如圖7(a)所示，在藍(lán)色通道我們觀察到強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，并能清楚地看到線粒體的分布，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，且和商業(yè)染料標(biāo)記的線粒體的觀察結(jié)果一致(圖7(b))。圖7(c)為細(xì)胞明場(chǎng)。如圖7(d)所示，我們與商業(yè)染料的線粒體定位效果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，探針的細(xì)胞熒光圖像與綠色通道的商業(yè)染料染色的細(xì)胞熒光圖像重疊率很高，重疊系數(shù)為Rr=0.92(圖7(e))。為了進(jìn)一步說明探針能特異性靶向線粒體，我們截取細(xì)胞熒光圖像的一段區(qū)域進(jìn)行熒光變化分析，如圖7(f)所示，在同一位置探針和商業(yè)染料的熒光變化幾乎同步進(jìn)行，更直觀地揭示了探針CMPH具有良好的線粒體靶向能力。

圖7 探針CMPH(10 μmol/L)和Mito-Tracker Green(0.5 μmol/L)共同染色HeLa細(xì)胞的線粒體共定位成像。(a)藍(lán)色通道：CMPH(λex=380 nm,λem=440～480 nm)；(b)綠色通道：Mito-Tracker Green(λex=488 nm,λem=500～540 nm)；(c)明場(chǎng)；(d)藍(lán)色通道和綠色通道疊加圖；(e)探針CMPH和Mito-Tracker Green的熒光強(qiáng)度相關(guān)性分布圖；(f)HeLa細(xì)胞的熒光強(qiáng)度剖面圖。比例尺：20.00 μm。Fig.7 Mitochondrial co-localization imaging of HeLa cells stained with CMPH(10 μmol/L) and Mito-Tracker Green(0.5 μmol/L).(a)Blue channel:CMPH(λex=380 nm,λem=440-480 nm).(b)Green channel:Mito-Tracker Green(λex=488 nm,λem=500-540 nm).(c)Bright.(d)Overlay of blue and green channels.(e)Fluorescence intensity correlation distribution map of probe CMPH and Mito-Tracker Green.(f)Fluorescence intensity profile of HeLa cells.Scale bars:20.00 μm.

3.5 細(xì)胞pH熒光成像

為了驗(yàn)證探針CMPH檢測(cè)線粒體pH變化的能力，我們用共聚焦顯微鏡觀察了不同pH環(huán)境下線粒體的熒光強(qiáng)度。使用不同pH的高K+緩沖液和尼日利亞菌素(10 μmol/L)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞30 min。如圖8所示，我們發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境下(pH=5.0)藍(lán)色通道的熒光較弱。隨著pH值增大到7.0和9.0，藍(lán)色通道的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，這與該探針的光學(xué)行為表現(xiàn)一致。與其他香豆素類pH熒光探針[30-34]相比(表1)，探針CMPH的pKa=7.79正好對(duì)應(yīng)線粒體弱堿性的pH范圍[35]，表明CMPH可用于線粒體pH變化的特異性響應(yīng)。

圖8 不同pH條件下的HeLa細(xì)胞熒光成像。藍(lán)色通道：CMPH(λex=380 nm,λem=440～480 nm)。比例尺：20.00 μm。Fig.8 Fluorescence imaging of HeLa cells under different pH conditions.Blue channel:CMPH(λex=380 nm,λem=440-480 nm).Scale bars:20.00 μm.

4 結(jié) 論

本文以香豆素為熒光團(tuán)、3-芐基-2-甲基苯并噻唑溴鹽為線粒體定位基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了一種線粒體靶向的pH熒光探針CMPH，該探針對(duì)于pH具有較高的特異性和可逆性熒光響應(yīng)。在探針濃度達(dá)20 μmol/L時(shí)，24 h后細(xì)胞依然具有較高的存活度，表明探針的生物兼容性高。共聚焦熒光成像結(jié)果表明，CMPH被成功固定在線粒體中，線粒體的分布清晰可見，并可通過熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)線粒體pH的波動(dòng)，揭示了探針CMPH具有監(jiān)測(cè)線粒體pH變化的能力，為線粒體分布及微環(huán)境波動(dòng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了一種新的性能優(yōu)良的成像工具。