劉瑞玲，潘旭婕，吳偉杰，韓延超，陳杭君，郜海燕

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310021）

火龍果（Hylocereus undatus）屬仙人掌科（Cactaceae）三角柱屬（Hylorereus）[1]，原產(chǎn)于墨西哥、中美洲和南美洲，因其健康特性和營養(yǎng)價(jià)值受到重視而被廣泛種植[2]。目前，市面上常見的火龍果品種主要有：白肉火龍果、紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）和紫紅肉火龍果（Hylocereus costaricensis）3 種。其中，紅肉火龍果果肉中富含白肉火龍果所缺少的甜菜色素，還含有豐富的不飽和脂肪酸、水溶性食物纖維等。除了有較高的營養(yǎng)價(jià)值外，紅肉火龍果在抗氧化方面對人體也有一定的輔助作用[3]。

果實(shí)中有機(jī)酸的組成與含量是影響果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要因素。果實(shí)中存在許多種類的有機(jī)酸，然而大多數(shù)果實(shí)通常以1 種有機(jī)酸為主，少數(shù)以多種為主[4]。根據(jù)主要有機(jī)酸的種類，可以將果實(shí)分為蘋果酸型果實(shí)、檸檬酸型果實(shí)和酒石酸型果實(shí)等[5]。果實(shí)中的有機(jī)酸代謝是一個復(fù)雜的生理過程，由有機(jī)酸的合成和降解共同決定[6]。有研究表明，蘋果酸是火龍果的主要有機(jī)酸[7]。蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和蘋果酸酶（NADP-ME）是蘋果酸代謝中關(guān)鍵的3 個酶，前兩者催化蘋果酸的合成，后者則參與蘋果酸的降解，它們共同調(diào)節(jié)了火龍果生長發(fā)育過程中蘋果酸的代謝和積累[8-10]，其含量是一個動態(tài)變化的過程，可影響火龍果的風(fēng)味品質(zhì)。

目前關(guān)于紅肉火龍果中蘋果酸的代謝變化還未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)研究了“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果貯藏過程中的品質(zhì)變化和蘋果酸代謝關(guān)鍵基因NADP-ME、PEPC 和NADMDH 的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究紅肉火龍果采后貯藏過程中蘋果酸積累的調(diào)控機(jī)制和對風(fēng)味特性形成的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 “玫瑰香”品種火龍果，采自浙江省江山市秋實(shí)家庭農(nóng)場；“大紅一號”品種火龍果，采自浙江省諸暨市雪鋒火龍果基地，保鮮車運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于10℃冷庫中預(yù)冷12 h。

1.1.2 試劑 磷酸二氫鉀、磷酸、福林-酚等（分析純級），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級甲醇、色譜級乙腈，購自美國迪馬科技公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸及琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；異硫氰酸苯酯、三乙胺、游離氨基酸混標(biāo)，購于美國Sigma試劑公司；PEPC 測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

TAXT Plus 型質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS 公司；PAL-1型手持折射儀，日本ATAGO 公司；877 Titrino plus 自動電位滴定儀，瑞士萬通股份有限公司；UV-9000 紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Waters 高效液相色譜儀（型號e2695-2998 配有PDA 檢測器），沃特世科技（上海）有限公司；微量分光光度計(jì)，日本SHIMADZY 公司；恒溫?cái)U(kuò)增PCR 儀，美國賽默飛世爾科技公司；微量核算蛋白測定儀，美國賽默飛世爾科技公司；Thermo MR23i 高速低溫冷凍離心機(jī)，法國捷安特集團(tuán)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

挑選無機(jī)械損傷，果實(shí)大小和成熟度相對一致的“玫瑰香”火龍果和“大紅一號”火龍果。用2%次氯酸鈉浸泡消毒后自然晾干，于25℃恒溫培養(yǎng)，每組3 次重復(fù)。分別在貯藏第0，1，2，3，4，5，6，7，8 天定期取樣，置于液氮中迅速凍存，混合后分裝至樣品袋中，于-80℃保存，用于后續(xù)品質(zhì)指標(biāo)測定。

1.3.1 硬度的測定 參考黃子娟[11]的方法，并稍作修改。采用質(zhì)構(gòu)儀測定火龍果的果皮硬度和果肉硬度，使用直徑2 mm 探頭（P/2 型），選取火龍果果實(shí)無鱗片的赤道部位進(jìn)行穿刺測定，重復(fù)3次，取平均值，單位為N。

1.3.2 可滴定酸含量的測定 采用可滴定酸自動電位滴定儀測定。果肉勻漿后過濾，取濾液1 mL，用去離子水定容至100 mL，以0.05 mol/L NaOH溶液滴定，記錄滴定終點(diǎn)時(shí)所用堿溶液的體積，并計(jì)算可滴定酸含量，重復(fù)3 次。

1.3.3 可溶性固形物含量的測定 采用手持折射儀測定樣品可溶性固形物含量，重復(fù)3 次。

1.3.4 維生素C 含量的測定 參考吳媛媛等[12]的方法。稱取1 g 火龍果研磨樣，加入5% TCA 溶液，混勻后離心。取上清液依次加入5%三氯乙酸、0.5%鄰菲羅琳-乙醇溶液、0.5%磷酸-乙醇溶液、0.03%三氯化鐵-乙醇溶液和1 mL 無水乙醇后于30℃水浴1 h。用蒸餾水調(diào)零，以蒸餾水代替上清液為參比。在波長534 nm 處測定吸光度值，重復(fù)3 次，單位為mg/100 g。

1.3.5 總酚含量的測定 采用福林酚比色法，參考范智義等[13]的方法，并作適當(dāng)修改。稱取火龍果研磨樣1.0 g，加入5.0 mL 60%乙醇浸提2 h，10 000×g 離心15 min，取上清液1 mL 至25 mL具塞試管中，加入3 mL 1.0 mol/L 福林酚試劑后搖勻，靜置5 min 后加入6 mL 7.5%碳酸鈉，用蒸餾水定容至25 mL。室溫下在暗處放置2 h，以不加沒食子酸的樣品為空白，于波長760 nm 處測定其吸光度值，重復(fù)3 次，以沒食子酸含量為標(biāo)準(zhǔn)物測定總酚含量，單位為μg/g。

1.3.6 可溶性糖含量的測定 參考曹健康等[14]的苯酚-硫酸法，并作適當(dāng)修改。稱取火龍果研磨樣1.0 g，加入5～10 mL 蒸餾水后封口，于100℃水浴30 min，冷卻后過濾，濾液移入100 mL 容量瓶，回收殘?jiān)尤?～10 mL 蒸餾水于100℃水浴10 min 后冷卻、過濾，合并濾液。取500 μL 樣品液于試管中，加入1.5 mL 蒸餾水和1.0 mL 9%苯酚，搖勻，在5～20 s 內(nèi)加入5 mL 濃硫酸，搖勻，室溫下反應(yīng)30 min，以空白為參比，在波長485 nm 處測定其吸光度值，重復(fù)3 次。

1.3.7 有機(jī)酸組分的測定

1）色譜條件C18 反相色譜柱（3.9 mm×300 mm，5 μm）；柱 30℃；流動相為0.04 mg/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液∶甲醇=95∶5（體積比）；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；配有PDA 檢測器，檢測波長214 nm；外標(biāo)法定量。

2）提取方法 采用高效液相色譜法，參考關(guān)秀杰等[15]的方法，并作適當(dāng)修改。稱取火龍果研磨樣5.0 g 于10 mL 容量瓶，加入一定量流動相，于75℃水浴45 min，冷卻至室溫，定容。渦旋2 min，超聲提取15 min，過濾分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。取一定量濾液，離心10 min 后用0.45 μm 孔徑的濾膜過濾上清液，備用。

1.3.8 NAD-MDH 和NADP-ME 酶活的測定

1）酶液提取參考Masashi 等[16]和Hirai等[17]的方法，稍作修改。取5 g 火龍果研磨樣，加入10 mL 經(jīng)預(yù)冷的研磨緩沖液（包含10 mmol/L 異抗壞血酸、0.6 mol/L 蔗糖、0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.2），低溫離心后取上清液。用pH 8.2 的提取緩沖液（包含10 mmol/L 異抗壞血酸、0.1%曲拉通X-100、0.2 mol/L Tris-HCl）定容到50 mL，混勻后用提取緩沖液定容至100 mL，酶液低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2）酶活測定NAD-MDH 和NADP-ME 酶活性測定參考Hirai 等[17]的方法。

1.3.9 PEPC 酶活的測定使用PEPC 測定試劑盒測定樣品中PEPC 的酶活。

1.3.10 總RNA 提取及檢測 使用天根多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取火龍果總RNA。取1 μL RNA 通過核酸蛋白測定儀測定OD260/OD280比值檢驗(yàn)RNA 純度，用普通瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA 完整性。

1.3.11 RT-qPCR 分析以總RNA 為模版，采用諾維贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在冰浴條件下進(jìn)行第1 鏈cDNA 的合成。

蘋果酸代謝相關(guān)基因引物（表1）通過Primer軟件自主設(shè)計(jì)，檢驗(yàn)引物熔解曲線單一（無特異性產(chǎn)物）后，可用于實(shí)時(shí)熒光定量分析。

表1 火龍果蘋果酸代謝相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequence of Hylocereus polyrhizus on malate metabolism related genes

基因表達(dá)分析均以YLS8 作為內(nèi)參基因[18]，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量，以3 個生物學(xué)重復(fù)的“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、Graphpad prism 8 軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中品質(zhì)的變化

果皮硬度和果肉硬度是反映火龍果耐貯性的重要指標(biāo)，能夠直觀反映火龍果果實(shí)采后軟化的程度[8]。如圖1a 和圖1b所示，在25℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長，火龍果的果皮硬度和果肉硬度逐漸下降，貯藏后期隨著腐敗嚴(yán)重，硬度下降很快?！懊倒逑恪逼贩N在第3 天和第5 天，“大紅一號”品種在第2 天和第5 天硬度均有上升現(xiàn)象，可能是由溫度較高，火龍果過度失水導(dǎo)致?！懊倒逑恪逼贩N火龍果在貯藏期間，果皮硬度下降了45.86%，果肉硬度下降了68.35%；“大紅一號”品種火龍果在貯藏期間，果皮硬度下降了46.68%，果肉硬度下降了59.28%。

在貯藏過程中由于呼吸作用，火龍果果實(shí)中的可溶性固形物作為呼吸底物會被消耗[19]。如圖1c 和圖1d所示，在貯藏過程中“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果的可溶性固形物和可溶性糖含量的總體變化不明顯，這可能是由于常溫貯藏使得糖代謝處于一個較高的水平，淀粉等糖類物質(zhì)分解為可溶性固形物的速率大于可溶性固形物作為底物被消耗的速率。圖1d 中“玫瑰香”品種火龍果的可溶性糖含量在第4 天達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢，可能是由于在貯藏前期糖類物質(zhì)分解為可溶性固形物的速率小于可溶性固形物作為底物被消耗的速率，貯藏后期糖類物質(zhì)含量降低，分解速率下降，果實(shí)呼吸作用消耗底物，導(dǎo)致可溶性糖含量下降。

圖1 不同品種紅肉火龍果在貯藏過程中品質(zhì)的變化Fig.1 Changes in quality decline of different varieties of red pitaya during storage

2.2 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中總酚和VC含量的變化

總酚是火龍果中重要的營養(yǎng)成分之一，多酚化合物具有清除自由基、防止衰老等功能[20]。如圖2a所示，“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果的總酚含量在貯藏期間呈現(xiàn)下降的趨勢。

VC 也是火龍果中重要的營養(yǎng)成分之一，能維持活性氧代謝平衡、延緩后熟軟化，是果實(shí)內(nèi)清除活性氧的一種重要的抗氧化劑，對延緩果實(shí)衰老有一定效果[21-22]?！懊倒逑恪逼贩N和“大紅一號”品種火龍果的VC 含量如圖2b所示，隨著貯藏時(shí)間的增加，VC 含量均呈現(xiàn)下降趨勢，與總酚含量的變化趨勢一致，說明隨著貯藏時(shí)間增加，果實(shí)逐漸軟化腐敗，火龍果的抗氧化能力下降。

圖2 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中VC 和總酚含量的變化Fig.2 Changes of VC and total phenol contents during storage of different varieties red pitaya

2.3 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中有機(jī)酸含量的變化

有機(jī)酸含量是影響果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要因素，不同的主要有機(jī)酸種類構(gòu)成了果實(shí)特殊的風(fēng)味[6，23]?！懊倒逑恪逼贩N火龍果和“大紅一號”品種火龍果的可滴定酸含量如圖3a所示，在貯藏期間呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于有機(jī)酸作為呼吸底物，通常在TCA 循環(huán)中被降解。通過測定“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果中7 種有機(jī)酸（分別為蘋果酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和乳酸）含量的變化趨勢，得出蘋果酸為2 個品種火龍果中含量最高的有機(jī)酸，這與Bellec 等[24]的研究結(jié)果一致，說明可滴定酸含量下降主要是由蘋果酸含量下降導(dǎo)致的。

圖3 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中有機(jī)酸含量的變化Fig.3 Changes of organic acid contents in different varieties of red pitaya during storage

2.4 不同品種紅肉火龍果蘋果酸代謝相關(guān)酶活性變化

蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）、蘋果酸酶（NADP-ME）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是影響蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶[25]。“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果果實(shí)中的有機(jī)酸主要以蘋果酸為主，蘋果酸代謝途徑是果實(shí)有機(jī)酸代謝的途徑之一，這與楊道富等[7]的研究結(jié)果一致。

蘋果酸的積累受蘋果酸代謝關(guān)鍵酶的調(diào)控，NAD-MDH 和PEPC 主要負(fù)責(zé)調(diào)控蘋果酸的合成，NADP-ME 主要負(fù)責(zé)蘋果酸的降解[26]。如圖4a和圖4b所示，在貯藏前期，2 個品種火龍果的NAD-MDH 和PEPC 活性也呈上升趨勢；在貯藏后期，蘋果酸的合成速度低于蘋果酸作為底物被消耗的速度，故呈下降的趨勢。從圖4c 可以看出，負(fù)責(zé)蘋果酸降解的NADP-ME 在火龍果貯藏過程中呈現(xiàn)上升的趨勢，這與蘋果[27]、櫻桃[28]中的蘋果酸代謝酶活變化一致，總體與2 個品種火龍果的蘋果酸含量趨勢一致。

圖4 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中蘋果酸代謝相關(guān)酶活變化Fig.4 Changes of malate metabolism related enzyme activities of different varieties of red pitaya during storage

相關(guān)性分析結(jié)果（表2）表明，“玫瑰香”品種火龍果的NAD-MDH 和PEPC 活性與蘋果酸含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），NADP-ME 活性與蘋果酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；“大紅一號”品種火龍果的NAD-MDH 活性與蘋果酸含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），PEPC 活性與蘋果酸含量呈正相關(guān)，NADP-ME 活性與蘋果酸含量呈負(fù)相關(guān)。

2.5 蘋果酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量的變化

采用RT-qPCR 測定火龍果蘋果酸代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量。NADP-ME 基因主要參與調(diào)控蘋果酸的降解，如圖5a所示，NADP-ME 的表達(dá)量在“玫瑰香”品種和“大紅一號”品種火龍果中均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在貯藏第8 天，該基因在“玫瑰香”品種中的表達(dá)量顯著高于“大紅一號”，且相關(guān)性分析（表2）表明“玫瑰香”品種NADP-ME 的相對表達(dá)量與酶活呈極顯著正相關(guān)；“大紅一號”品種的NADP-ME 相對表達(dá)量與酶活呈顯著正相關(guān)，表明NADP-ME 基因的表達(dá)水平與火龍果果實(shí)貯藏過程中蘋果酸含量密切相關(guān)，直接影響果實(shí)的口感和風(fēng)味。

表2 蘋果酸含量、蘋果酸代謝相關(guān)酶及基因間Pearson 相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficients among malic acid content，malic acid metabolism-related enzymes and genes

PEPC 和NAD-MDH 基因是果實(shí)發(fā)育過程中蘋果酸代謝的關(guān)鍵基因，與蘋果酸的合成相關(guān)。PEPC 和NAD-MDH 主要參與蘋果酸的合成。由圖5b 可知，PEPC 相對表達(dá)量在貯藏過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的丙酮酸被還原為乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可轉(zhuǎn)化為蘋果酸的丙酮酸含量降低，間接導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蘋果酸含量的降低。在貯藏第6 天，“玫瑰香”品種的PEPC 相對表達(dá)量達(dá)到峰值，與PEPC 酶活性呈負(fù)相關(guān)；在貯藏第4 天，“大紅一號”品種的相對表達(dá)量達(dá)到峰值，與PEPC 酶活呈正相關(guān)。如圖5c所示，NAD-MDH相對表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，相關(guān)性分析表明，“玫瑰香”品種的NAD-MDH 相對表達(dá)量與酶活呈極顯著正相關(guān)；“大紅一號”品種的NAD-MDH 相對表達(dá)量與酶活呈顯著正相關(guān)，這與Famiani 等[29]的研究結(jié)果一致。PEPC 和NADMDH 2 個基因的相對表達(dá)水平與火龍果果實(shí)貯藏過程中蘋果酸的積累密切相關(guān)，直接影響果實(shí)的口感和風(fēng)味。

圖5 不同品種紅肉火龍果貯藏過程中蘋果酸代謝相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig.5 Changes in the expression of malate metabolism-related genes of different varieties of red pitaya during storage

3 結(jié)論

紅肉火龍果采后品質(zhì)劣變由果皮和果肉硬度下降及可滴定酸、抗壞血酸、總酚含量降低共同導(dǎo)致。蘋果酸為紅肉火龍果果實(shí)中有機(jī)酸的主要成分，其含量變化導(dǎo)致果實(shí)有機(jī)酸含量下降。負(fù)責(zé)蘋果酸合成的NAD-MDH 和PEPC 的酶活性與蘋果酸含量呈正相關(guān)，而負(fù)責(zé)蘋果酸降解的NADP-ME則與蘋果酸含量呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究測定蘋果酸相關(guān)代謝酶NADP-ME、PEPC 和NAD-MDH 基因水平變化，發(fā)現(xiàn)蘋果酸代謝相關(guān)基因水平的變化與酶活的變化趨勢一致?；瘕埞珊筚A藏過程中，PEPC 和NAD-MDH 的基因水平呈下降趨勢，而NADP-ME 的基因水平呈上升趨勢，使得果實(shí)中蘋果酸合成受阻，降解加劇，最終導(dǎo)致蘋果酸含量下降，火龍果在貯藏過程中品質(zhì)變劣。