孟 妍，曾劍華，李美瑩，王子玥，楊宏哲，石彥國(guó)，朱秀清

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省谷物食品與谷物綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱150076）

漢麻又稱大麻、火麻。我國(guó)漢麻品種繁多，主要包括巴西火麻、云南漢麻、甘肅清麻、六安寒麻等。其籽仁中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量豐富，分別約占20%～25%和50%～55%。此外，其籽仁中還含有人體所必需的鈣、鉀、磷、鎂、鐵和鋅等礦物質(zhì)元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高[1-2]。隨著市場(chǎng)對(duì)健康食品的需求不斷增加，漢麻籽蛋白成為新興的植物蛋白源。

漢麻籽蛋白（Hemp protein isolate，HPI）由球蛋白和白蛋白組成，其中球蛋白含量高達(dá)65%[3]，其分子是由酸性亞基和堿性亞基通過(guò)二硫鍵連接組成的六聚體[4]。白蛋白含量較少，約占35%。HPI富含20 種氨基酸，包括8 種人體必需氨基酸[3]，其中精氨酸含量最為豐富[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)漢麻籽蛋白的研究主要在提取技術(shù)以及功能性這兩方面。提取技術(shù)主要包括膠束提取法和堿溶酸沉法。Murray 等[6]采用膠束提取法提取HPI，在膠束化過(guò)程中去除非蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，得到的分離蛋白純度高達(dá)98.8%。Tamara 等[7]采用堿溶酸沉法提取HPI，蛋白純度達(dá)到91.44%。張維等[8]提取所得HPI 的蛋白質(zhì)純度為83.8%。張濤[9]嘗試采用堿溶酸沉法提取HPI，純度達(dá)92.39%。雖然膠束法提取得到的HPI 蛋白質(zhì)純度高于堿溶酸沉法，但是其操作較繁瑣，不利于工業(yè)生產(chǎn)，而堿溶酸沉法操作簡(jiǎn)單，便于工業(yè)化生產(chǎn)，故本試驗(yàn)選取堿溶酸沉法提取HPI，旨在優(yōu)化提取技術(shù)獲得蛋白質(zhì)純度較高的HPI。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)漢麻籽蛋白的功能性研究主要集中在溶解性、凝膠性、起泡性和乳化性等。乳化性是HPI 重要的功能特性，具有廣泛的用途。目前對(duì)于HPI 乳化性的研究主要是在不同蛋白質(zhì)濃度和鹽離子添加量等方面。Malomo 等[10]研究在相同蛋白質(zhì)濃度下，球蛋白在pH 3.0 和5.0 時(shí)乳化穩(wěn)定性高于白蛋白，而在pH 7.0 時(shí)乳化穩(wěn)定性低于白蛋白。在高鹽濃度條件下，HPI 乳狀液會(huì)形成強(qiáng)有力的界面膜，乳化穩(wěn)定性處于穩(wěn)定狀態(tài)。低鹽濃度時(shí)HPI 乳化活力下降，乳化穩(wěn)定性增大；高鹽濃度時(shí)乳化活力上升，乳化穩(wěn)定性減弱[11]。目前，pH值協(xié)同熱處理對(duì)HPI 乳化性的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝獲得蛋白質(zhì)純度較高的HPI，在此基礎(chǔ)上，采用pH 值協(xié)同熱處理對(duì)HPI 乳化性進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在為HPI 深加工利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢麻籽籽仁，廣西巴馬縣；濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硼酸、硫酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純級(jí)），天津市天力化學(xué)有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

FW100 粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；HH-S4 恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；PCE-E3000 恒溫振蕩器，蘇州凱特爾儀器有限公司；DHG-912A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?？萍加邢薰荆籘G16-WS 離心機(jī)、Alpha 1-2 LDplus 冷凍干燥機(jī)，湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HFVP-Ⅱ消化爐，上海纖檢科技有限公司；220V-AC 電爐，上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；XHF-DY 高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；BS224S 分析天平，賽多利斯科學(xué)有限公司；DYY-6D 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Alpha-1506 分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；pHS-25 pH 計(jì)，杭州杰源儀器科技有限公司；Nazo Zetasizer 90馬爾文激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂漢麻籽餅粕的制備 稱取一定量的漢麻籽，按料液比1∶8 加入正己烷，室溫振蕩脫脂8 h，烘干備用。

1.3.2 漢麻籽分離蛋白提取 稱取脫脂漢麻籽餅粕與去離子水以一定的料液比混合，調(diào)節(jié)料液pH值至8.5，振 蕩（200 r/min，60 min，25℃）堿 提1 h，于4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心20 min，獲取上清液，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至4.7，室溫下（25℃）靜止30 min，離心（10 000 r/min，20 min）后棄去上清液獲得漢麻籽蛋白凝乳。調(diào)節(jié)漢麻籽蛋白凝乳pH 值為7.0，冷凍干燥得到漢麻籽分離蛋白，備用。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 以蛋白提取率為指標(biāo)，分別對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取pH 值、酸沉pH 值5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。設(shè)定料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，提取溫度為30，35，40，45，50℃，提取時(shí)間30，60，90，120，150 min，提取pH 8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，酸沉pH 4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn) 通過(guò)單因素試驗(yàn)選取主要影響因素料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、提取pH 值（D），以漢麻籽分離蛋白提取率（R）為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3.5 漢麻籽分離蛋白理化指標(biāo)測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；灰分的測(cè)定：參照GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；水分含量測(cè)定：參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳檢測(cè) 取0.5 mL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 樣品溶液加入0.5 mL 樣品緩沖液（含有0.2 mL 10%SDS 和50 μL 0.01 mol/L β-巰基乙醇）混勻后，沸水浴10 min，上樣量為20 μL（Marker 上樣量5 μL）。樣品進(jìn)入5%濃縮膠時(shí)電壓為120 V，進(jìn)入12%分離膠時(shí)電壓為100 V。樣品跑至距底部1 cm 處時(shí)停止電泳取出凝膠，采用考馬斯亮藍(lán)染液染色，30 min 后用脫色液脫色，多次更換脫色液，直至背景清晰[12-13]。

1.3.7 漢麻籽分離蛋白功能特性測(cè)定 設(shè)置pH 7.0，水浴加熱30 min 為固定條件，考察溫度（25，35，45，55，65，75，85，95℃）對(duì)漢麻籽分離蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響。

設(shè)置溫度55℃，水浴加熱30 min 為固定條件，考察pH 值（2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0）對(duì)漢麻籽分離蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響。

設(shè)置溫度55℃，pH 7.0 為固定條件，考察加熱時(shí)間（0，15，30，45，60，75，90，105，120 min）對(duì)漢麻籽分離蛋白溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響。

1.3.8 漢麻籽分離蛋白溶解性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]的方法并稍作修改。配制2 mg/mL 蛋白溶液，用0.5 mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 值分別為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，于4 000 r/min 離心15 min 后備用。取20 μL 樣品溶液加水至100 μL，之后加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)，在渦旋振蕩器上混勻，于波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定吸光度，以pH值為橫坐標(biāo)、蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)量濃度-pH 值標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白溶解性按式（2）計(jì)算：

1.3.9 漢麻籽分離蛋白乳化性測(cè)定 配制1%的漢麻籽分離蛋白溶液，分別以溫度、pH 值、加熱時(shí)間和靜置時(shí)間變量測(cè)定漢麻籽分離蛋白的乳化性。取10 mL 漢麻籽分離蛋白溶液加入20 mL 大豆色拉油中，在高速分散機(jī)上均質(zhì)（12 000 r/min，3 min）形成均勻的乳化液然后靜置。分別在靜置后的第0 分鐘和第10 分鐘從底部吸取100 μL 乳化液，用5 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）稀釋?zhuān)诓ㄩL(zhǎng)500 nm 條件下測(cè)定吸光值。乳化活性（EAI）用第0 分鐘的樣品吸光值A(chǔ)0 表示[14-15]。

式中，N——稀釋倍數(shù)；c——蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；Φ——光程長(zhǎng)，取值0.01；?——體積分?jǐn)?shù)，取值0.65。

1.3.10 乳化穩(wěn)定性測(cè)定取1.3.9 節(jié)的乳化液[16-17]進(jìn)行高速離心之后，用Nazo Zetasizer 90馬爾文激光粒度儀測(cè)其粒徑大小。儀器設(shè)置為自動(dòng)測(cè)量每個(gè)乳化液的粒徑大小，3 次平行。將乳化液室溫保存30 min 后，再次測(cè)其乳狀液粒徑，得其乳化穩(wěn)定性。

1.3.11 乳液形態(tài)表征 先將漢麻籽蛋白-大豆油乳化體系均質(zhì)，再?gòu)牡撞咳?00 μL 乳液滴在干凈載玻片上，確保沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，用蓋玻片蓋緊后，放置于光學(xué)顯微鏡下，在10 倍目鏡、40 倍物鏡的條件下，觀察形態(tài)特征并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有測(cè)定重復(fù)3 次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)采用Origin 8.5 與Design Expert 8.0.6 進(jìn)行分析和繪制。用SPSS 19.0 進(jìn)行ANONA單因素方差分析，并采用Ducan 檢驗(yàn)（P＜0.05）數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 料液比對(duì)漢麻籽分離蛋白提取率的影響隨著料液比的增大，蛋白提取率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶20 時(shí)，蛋白提取率達(dá)到36.37%。料液比繼續(xù)增大，蛋白提取率為36.42%和36.54%，趨于平衡狀態(tài)，沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。當(dāng)料液比低于1∶20 時(shí)，體系黏稠度較大，分子擴(kuò)散速率較低，提取液分布不均，降低了傳質(zhì)效率[18]；當(dāng)料液比增大時(shí)，稀釋作用加強(qiáng)，溶液體系黏度下降，傳質(zhì)效率提高，蛋白質(zhì)溶出率增大，因而HPI 提取率增大；當(dāng)料液比大于1∶20 時(shí)，蛋白質(zhì)溶解達(dá)到飽和，提取率不再升高?？紤]到后續(xù)試驗(yàn)的處理過(guò)程，本試驗(yàn)選擇料液比1∶20 作為最佳的料液比參數(shù)。

圖1 料液比對(duì)HPI 提取率的影響Fig.1 Effects of ratio of water to material on extraction rate of HPI

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)漢麻籽分離蛋白提取率的影響 因?yàn)槊撝瑵h麻籽餅粕的溶脹需要一定的時(shí)間，所以隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白提取率逐漸升高。根據(jù)斐克擴(kuò)散定律，物料中可溶性物質(zhì)的溶出量與浸提時(shí)間成正比[19]。當(dāng)提取時(shí)間為60 min 時(shí)，蛋白提取率達(dá)到36.3%。時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，漢麻籽蛋白溶解度不再升高，提取率趨于平衡，說(shuō)明可溶性蛋白基本已經(jīng)全部浸出?？紤]到后續(xù)試驗(yàn)的處理過(guò)程，本試驗(yàn)選擇60 min 作為最佳提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction rate of protein

2.1.3 提取溫度對(duì)漢麻籽分離蛋白提取率的影響 隨著提取溫度升高，蛋白提取率逐步升高。當(dāng)提取溫度達(dá)到45℃時(shí)，蛋白提取率達(dá)到37.22%。溫度繼續(xù)上升，溶液體系黏度下降、傳質(zhì)速度增大，使HPI 提取率增大；同時(shí)溫度升高，分子的擴(kuò)散速率增加，提取率上升。若提取溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的伸展使疏水核心暴露，通過(guò)疏水作用聚集沉淀；此外高溫會(huì)引起部分蛋白發(fā)生變性，生成不溶性聚集體，降低了蛋白提取率[20]，并且50℃的提取率與45℃相比沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。綜合各個(gè)因素考慮，選擇45℃作為最佳提取溫度。

2.1.4 提取pH 值對(duì)漢麻籽分離蛋白提取率的影響 隨著提取pH 值的增大，蛋白提取率逐漸升高。當(dāng)提取pH 值為8.5 時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高33.21%。適當(dāng)提高pH 值有利于增大蛋白表面電勢(shì)，增強(qiáng)靜電引力從而促進(jìn)蛋白溶解，提高蛋白提取率。由于提取pH 值太高會(huì)導(dǎo)致賴氨酸與丙氨酸或胱氨酸之間發(fā)生縮合反應(yīng)[20]，故選擇pH 8.5為最佳提取條件。

圖3 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction rate of protein

圖4 提取pH 值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of extraction pH value on extraction rate of protein

2.1.5 酸沉pH 值對(duì)漢麻籽分離蛋白提取率的影響 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在酸性溶液中呈陽(yáng)離子，在堿性溶液中呈陰離子，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的pH 值為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。由圖5可以看出，當(dāng)pH=4.7 時(shí)，漢麻籽蛋白含量最高，此時(shí)酸沉效果最好；當(dāng)pH＜4.7 時(shí)，蛋白提取率較低；當(dāng)pH＞4.7 時(shí)，隨著pH 值的增加，蛋白提取率有下降的趨勢(shì)。綜上，選擇pH 4.7 為漢麻籽蛋白的等電點(diǎn)。

圖5 酸沉pH 值對(duì)蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of pH value of acid precipitation on extraction rate of protein

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、提取時(shí)間、提取溫度和提取pH值利用Design-Expert 8.0 軟件按照Box-Behnken原理設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的試驗(yàn)方案對(duì)HPI 提取進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design proposal and experiment result of response surface

利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到蛋白提取率（Y）與料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、提取pH（D）的二次響應(yīng)面回歸方程為：

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

Y=35.33-0.027A+0.52B-0.43C-0.84D-0.11AB-0.072AC-0.93AD-0.51BC-1.39BD+0.49CD-0.96A2-1.30B2-0.96C2-0.93D2。

（續(xù)表3）

表3可知，模型在P≤0.001 時(shí)水平極其顯著，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)是可靠的，試驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)R2=0.9803，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值相關(guān)性較好，模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的描述很好。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型的一次項(xiàng)B，C，D 差異極顯著；交互項(xiàng)AD，BD 差異極顯著，BC 較顯著；二次項(xiàng)A2，B2，C2，D2極顯著。說(shuō)明各影響因素對(duì)漢麻籽分離蛋白的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。對(duì)回歸方程進(jìn)行中心標(biāo)準(zhǔn)化處理，回歸方程Y 一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小依次為D，B，C，A，表明4 個(gè)因素對(duì)蛋白提取率影響順序?yàn)椋禾崛H值＞提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。

分別將模型中的料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、提取pH 值（D）的其中1 個(gè)因素固定在0 水平，得到另外2 個(gè)因素交互作用對(duì)蛋白提取率Y 的模型，并根據(jù)模型分別繪制響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖6。

2.2.2 各因素對(duì)漢麻籽蛋白提取率的影響 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的曲面圖，分析曲面圖可以看出各參數(shù)之間的相互作用和最佳參數(shù)[21]。如圖6c，6d，6e，較為明顯的反映了各因素對(duì)漢麻籽蛋白提取率的影響。

圖6c 為料液比和提取pH 值對(duì)蛋白提取率的影響。當(dāng)提取時(shí)間60 min，提取溫度45℃時(shí)，由圖6c 的曲面圖可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取率隨著提取pH 值增大而先升高后下降；提取pH 值越大，提取率隨著料液比增大而先升高后下降。

圖6d 為提取時(shí)間和提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響。當(dāng)料液比1∶20，提取pH 8.5 時(shí)，由圖6d的曲面圖可知，料液比升高，提取率隨著提取pH值增大，曲面圖先升高后下降的趨勢(shì)越顯著；提取pH 越大，提取率隨著提取時(shí)間越長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。

圖6e 為提取時(shí)間與提取pH 值對(duì)蛋白提取率的影響。當(dāng)料液比1∶20，提取溫度45℃時(shí)，由圖6e 的曲面圖可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取率隨著提取pH 增大，曲面圖呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)越明顯；提取pH 越大，提取率隨著提取時(shí)間增大先升高后下降的趨勢(shì)越明顯。

圖6 兩因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.6 Respose surface of interaction between two factors

由圖6可知，Y 隨著各因素值的增加而呈上升趨勢(shì)，達(dá)到一定值后，Y 開(kāi)始逐漸下降。提取時(shí)間、提取溫度、提取pH 值對(duì)蛋白提取率影響顯著，曲線相對(duì)較陡，料液比與之相比較，曲線較平滑，響應(yīng)值變化較小，其中料液比對(duì)蛋白提取率的影響最不顯著。

2.2.3 最佳提取條件及驗(yàn)證 對(duì)簡(jiǎn)化后的回歸模型進(jìn)行分析，在試驗(yàn)所取的水平范圍內(nèi)求蛋白提取率最優(yōu)值，得到最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶20.48，提取時(shí)間70.74 min，提取pH 8.32，提取溫度43.63℃，此條件下蛋白提取率為35.92%。

為驗(yàn)證最佳工藝參數(shù)的可靠性，結(jié)合試驗(yàn)的可行性，選取料液比為1∶20、提取時(shí)間70 min、提取pH 8.3、提取溫度44℃。在此條件下進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到漢麻籽蛋白提取率為（34.9 ±0.62）%，與理論值的偏差為0.4%，沒(méi)有顯著性差異，這說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化的模型回歸方程及最佳條件可靠，該回歸方程可以應(yīng)用。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)漢麻籽分離蛋白提取率的影響 在獲得響應(yīng)面最佳工藝條件的基礎(chǔ)上，考察提取次數(shù)對(duì)HPI 提取率的影響。如圖7所示，隨著提取次數(shù)的增加，蛋白提取率有所上升。提取1 次與提取2 次之間比較，提取率增加較為明顯；分別為34.9%和39.15%。提取2 次與提取3 次之間比較，提取率增加較平緩，說(shuō)明可溶性蛋白幾乎全部提取出來(lái)?？紤]到節(jié)省電能、時(shí)間和提取液用量等綜合因素，選取提取次數(shù)2 次作為HPI 提取的最佳條件。

圖7 提取次數(shù)對(duì)蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of extraction times on extraction rate of protein

2.3 漢麻籽蛋白的理化性質(zhì)

對(duì)通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的漢麻籽分離蛋白進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定，其蛋白質(zhì)含量為（93.54 ±0.54）%，水分（2.82 ±0.12）%，灰分（2.38 ±0.23）%。

2.4 漢麻籽蛋白SDS-PAGE 分析

由圖8可知，以大豆分離蛋白為參照，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析可知HPI 主要組分為麻仁球蛋白，其含有2 個(gè)亞基，分別為酸性亞基和堿性亞基，分子量為37 ku 和21 ku。通過(guò)Densi-tometric 掃描技術(shù)對(duì)HPI 組分進(jìn)行分析，麻仁球蛋白組分占HPI 76.41%，白蛋白占23.59%左右。除酸性亞基和堿性亞基條帶外，51 ku 左右有一條明顯的條帶，分子質(zhì)量小于12 ku 也有部分條帶，可能與HPI 中白蛋白成分相對(duì)應(yīng)，此結(jié)論與Tang 等[22]的研究結(jié)論一致。

圖8 電泳分析圖Fig.8 SDS-PAGE of HPI

2.5 HPI 溶解特性表征

蛋白質(zhì)水化作用的指標(biāo)之一是蛋白質(zhì)在水中的溶解性，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、水-水、蛋白質(zhì)-水相互作用的綜合結(jié)果，分析蛋白質(zhì)的溶解性是研究蛋白其它功能特性的前提。

2.5.1 pH 值對(duì)HPI 溶解性的影響由圖9可知，不同pH 值條件下，蛋白質(zhì)溶解性PDI 存在很大差異。在pH 4～5 之間，HPI 溶解性最低；pH=4.7時(shí)，HPI 溶解度達(dá)到1.47%，由此判斷HPI 等電點(diǎn)為4.7，在等電點(diǎn)附近蛋白溶解性最低，與酸沉條件相一致。HPI 處于等電點(diǎn)時(shí)，其自身的靜電荷為零，蛋白質(zhì)之間的靜電排斥力較低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集而產(chǎn)生沉淀[12]；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，HPI 溶解性較高。由于堿性條件下有利于HPI 中球蛋白分子解離，故在pH 大于12 時(shí)，HPI 溶解度高達(dá)80%以上，說(shuō)明HPI 是一種典型的堿溶性蛋白[10，23]。

2.5.2 加熱溫度對(duì)HPI 溶解性的影響 加熱可以分解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的溶解度增高。由圖10可知，當(dāng)溫度低于55℃時(shí)，PDI 隨著溫度的升高而逐漸增大；當(dāng)溫度為55℃時(shí)，HPI 的PDI 達(dá)到最大；當(dāng)溫度高于55 時(shí)，PDI 隨溫度升高而降低，這是由于熱運(yùn)動(dòng)的增加導(dǎo)致漢麻籽蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集而產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致溶解度降低[14，24-25]。

圖10 加熱溫度對(duì)PDI 的影響Fig.10 Effects of temperature on PDI

2.5.3 加熱時(shí)間對(duì)漢麻籽分離蛋白溶解性的影響 適當(dāng)?shù)募訜峥梢允沟鞍踪|(zhì)分子伸展，增加蛋白質(zhì)溶解度。然而，加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，小分子可溶性蛋白聚集成大分子蛋白，從而使溶解度降低。適當(dāng)控制加熱時(shí)間可避免蛋白溶解度的降低。由圖11可知，隨著加熱時(shí)間的增加，漢麻籽蛋白溶解性逐漸升高。當(dāng)加熱時(shí)間為60 min 時(shí)，HPI 溶解性達(dá)到最大；繼續(xù)增大加熱時(shí)間，溶解性降低[26]。

圖11 加熱時(shí)間對(duì)溶解性的影響Fig.11 Effects of heating time on PDI

2.6 HPI 乳化性表征

乳化性是蛋白質(zhì)的重要功能性質(zhì)之一。在食品乳化體系中，添加適量蛋白質(zhì)有助于降低油水界面張力，避免油滴聚集，從而提高體系穩(wěn)定性[27-29]。影響蛋白質(zhì)乳化性的因素有溫度，蛋白質(zhì)溶解度、pH 值等。

2.6.1 pH 值對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響 由圖9可知，HPI 等電點(diǎn)為4.7，PDI 為1.47%，由于蛋白質(zhì)自身靜電荷為零，蛋白質(zhì)之間的靜電排斥相互作用較弱，溶解性最小，吸附在油水界面的蛋白質(zhì)含量減少，所以乳化性較低。偏離等電點(diǎn)時(shí)，HPI 溶解性升高，利于蛋白界面載量的提高和高黏彈膜的形成[30-31]，乳化性升高，表現(xiàn)出良好的乳化性能，蛋白質(zhì)乳化性和溶解性呈現(xiàn)正相關(guān)。pH 7.0 時(shí)，乳化穩(wěn)定性最好（78.3%），說(shuō)明蛋白質(zhì)在中性條件下能體現(xiàn)優(yōu)良的乳化穩(wěn)定性。

圖9 pH 值對(duì)PDI 的影響Fig.9 Effects of pH value on PDI

2.6.2 溫度對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響 溫度對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖13，HPI 溶解性隨著溫度的升高，先升高后降低在55℃時(shí)HPI 溶解性達(dá)到最高（57.36%）。由圖13可知，HPI 乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著溫度的升高先升高后降低，其乳化性和乳化穩(wěn)定性與溶解性趨勢(shì)相同，在55℃時(shí)達(dá)到最高（265.88 m2/g）。溫度升高使蛋白質(zhì)分子伸展程度變大，更易吸附在油水界面。溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)受熱過(guò)高產(chǎn)生聚集，導(dǎo)致溶解度降低。加熱能降低吸附在界面上的蛋白質(zhì)膜的黏度和硬度，且高溫使乳化顆粒運(yùn)動(dòng)加劇，因此乳化性和乳化穩(wěn)定性均下降[32-33]。

圖12 pH 值對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effects of pH value on emulsification and emulsification stability

圖13 溫度對(duì)乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effects of different temperature on emulsification and emulsification stability

2.6.3 加熱時(shí)間對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性影響 選擇55℃，pH 7 的條件下對(duì)HPI 進(jìn)行加熱，加熱時(shí)間對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響如圖14所示。隨著加熱時(shí)間的增長(zhǎng)，HPI 溶解性升高，可溶性蛋白增多，形成界面膜，使得蛋白乳化性逐漸升高。當(dāng)加熱60 min 時(shí)，蛋白乳化性達(dá)到最高（257.42 m2/g），繼續(xù)延長(zhǎng)加熱時(shí)間，蛋白乳化性降低，可能是由于蛋白質(zhì)分子在加熱過(guò)程中發(fā)生部分變質(zhì)使得溶解度降低所致。

圖14 加熱時(shí)間對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.14 Effects of heating time on emulsification and emulsification stability

2.6.4 靜置時(shí)間對(duì)HPI 乳化性及乳化穩(wěn)定性影響 選取55℃，pH 7，加熱時(shí)間60 min 的HPI，其靜置時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)乳化性及乳化穩(wěn)定性影響如圖15所示。隨著時(shí)間的增加，乳化性及乳化穩(wěn)定性逐漸降低，在40 min 時(shí)乳化性及乳化穩(wěn)定性雖最低，但是與大豆分離蛋白的乳化性（80 m2/g）[34-36]相比，漢麻籽分離蛋白具有很好的乳化性，可作為較好的乳化劑原料。

圖15 不同靜置時(shí)間對(duì)乳化性及乳化穩(wěn)定性影響Fig.15 Effects of different standing time on emulsification and emulsification stability

2.7 乳狀液光學(xué)顯微鏡觀察

采用光學(xué)顯微鏡觀察乳化液液滴顆粒分布情況。由圖16可知，HPI 變性前后乳液粒徑變化較大，未經(jīng)處理的乳液液滴顆粒較大且分布不均，最優(yōu)乳化條件處理后形成的乳液液滴顆粒較小且分布較為均勻，沒(méi)有產(chǎn)生明顯的液滴聚集現(xiàn)象。乳液發(fā)生聚集或絮凝現(xiàn)象可判斷乳液穩(wěn)定性，因此在漢麻籽蛋白乳液的制作過(guò)程中，控制溫度、pH 值、加熱時(shí)間范圍有助于蛋白乳化體系的形成。蛋白乳化性越好，其形成的乳液粒徑越小[37]。

圖16 乳狀液形態(tài)特征Fig.16 Photomicrographs of hempseed protein emulsions

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法建立以漢麻籽蛋白提取率為響應(yīng)值，料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取pH 值為因變量的漢麻籽蛋白提取工藝?yán)碚撃Ｐ停Ｐ蛿M合度良好。方差分析得出，四因素對(duì)蛋白提取率影響大小為：提取pH 值＞提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比，最終確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶20，提取時(shí)間70 min，提取pH 8.3，提取溫度44℃，測(cè)得蛋白質(zhì)實(shí)際提取率為（39.15 ±0.28）%。用該工藝提取漢麻籽分離蛋白，其蛋白質(zhì)含量達(dá)到（93.54 ±0.54）%，水分為（2.82 ±0.12）%，灰分為（2.38±0.23）%，分子質(zhì)量主要分布在20～50 ku 之間。研究發(fā)現(xiàn)，漢麻籽蛋白的溶解特性和乳化特性與經(jīng)典的植物蛋白變化相符，漢麻籽蛋白乳化性在pH 2～10 條件下先降低后升高，隨著溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，乳化性先升高后降低。在pH 10，溫度55℃，加熱時(shí)間60 min 時(shí)，漢麻籽蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性達(dá)到最高，分別為305.53 m2/g 和92.04%。與最優(yōu)乳化條件處理后的漢麻籽蛋白相比，未處理的漢麻籽蛋白乳狀液粒徑大小分布不均勻，有大液滴存在；最優(yōu)條件處理后的漢麻籽蛋白乳液粒徑分布均勻，粒徑變化不大，乳化穩(wěn)定性較好，并且其乳化性在不同條件下均優(yōu)于大豆蛋白，可作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白原料，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。