孫學(xué)穎，辛?xí)早瑒⒔?，?燁，趙麗華

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018）

發(fā)酵香腸是指將去除筋膜的動物肉和脂肪絞碎，添加發(fā)酵劑、食鹽、香辛料等充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠊嗄c，在自然或人工控制條件下，經(jīng)發(fā)酵制成的具有獨特風(fēng)味、可長期貯藏的發(fā)酵肉制品[1]。為了賦予香腸更好的色澤、風(fēng)味及安全性，通常加入硝酸鹽或亞硝酸鹽進(jìn)行腌制。硝酸鹽可被還原生成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽可與二級胺經(jīng)亞硝基化作用，在體內(nèi)、體外結(jié)合生成亞硝胺[2-3]。目前已證實90%N-亞硝基化合物中可誘導(dǎo)不同器官的腫瘤，嚴(yán)重危害健康[4]。長時間小劑量攝入或者一次高劑量攝入亞硝胺類化合物，均可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，而且它們誘發(fā)的腫瘤可以在任何器官，甚至還能通過胎盤和乳汁引起后代癌變[5]。由于原料肉中富含蛋白質(zhì)和氨基酸，經(jīng)蛋白酶和氨基酸脫羧酶作用會生成某些胺類物質(zhì)，香腸在發(fā)酵階段溫度升高導(dǎo)致酶活升高，促進(jìn)胺類物質(zhì)的生成，而胺類物質(zhì)為N-亞硝胺形成的底物[6]，因此在發(fā)酵香腸制作過程中控制N-亞硝胺含量對于食品安全和品質(zhì)控制具有十分重要的意義。

目前亞硝胺的控制研究主要集中在阻斷N-亞硝胺的形成、促進(jìn)N-亞硝胺的分解、減少N-亞硝胺的前體物質(zhì)3 個方面，主要從原料及加工工藝[7]、發(fā)酵劑[8]、外源添加物（香辛料及植物提取物等）進(jìn)行控制[8-10]。其中，接種優(yōu)良發(fā)酵劑和添加香辛料是目前控制發(fā)酵肉制品中亞硝胺最常見、最有效的方法。研究表明，接種發(fā)酵劑可有效控制亞硝酸鹽、生物胺和亞硝胺含量[11]。接種發(fā)酵劑菌株可降低亞硝酸鹽殘留量[12]，如商業(yè)發(fā)酵劑PROMIX5 和LC 單菌均能顯著降低9 種N-亞硝胺總量[13]。研究表明，香辛料提取物對風(fēng)干腸中亞硝酸鹽和亞硝胺具有明顯的清除和阻斷作用，由強到弱的依次是桂皮、丁香和花椒[14]，這是由于香辛料提取物通過氧化-還原反應(yīng)降低亞硝酸鹽積累，從而阻斷亞硝胺的形成。發(fā)酵劑種類和不同香辛料均會對肉制品中N-亞硝胺的抑制效果產(chǎn)生很大的影響，目前發(fā)酵劑和香辛料共同作用的研究報道較少。

在本試驗腌制過程中分別添加香辛料、接種復(fù)合發(fā)酵劑或?qū)⒍咄瑫r添加，經(jīng)發(fā)酵、干燥、成熟制得發(fā)酵劑組、沙蔥+孜然組和沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組4 組發(fā)酵香腸產(chǎn)品，通過對產(chǎn)品的pH 值、水分活度、微生物指標(biāo)、亞硝酸鹽、生物胺和N-亞硝胺等相關(guān)指標(biāo)的測定，同時與對照組相比，分析復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸安全品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇尼特羊后腿肉、羊尾脂肪采于內(nèi)蒙古烏拉特中旗。復(fù)合發(fā)酵劑配比為V木糖葡萄球菌∶V肉葡萄球菌∶V37X-3∶V37X-6=1∶1∶2∶1[15]；木糖葡萄球菌（編號CICC 22943），中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；肉葡萄球菌（編號CIMT.044），廣東省微生物菌種保藏中心；戊糖片球菌（37X-3）和植物乳桿菌（37X-6），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“肉品科學(xué)與技術(shù)”團(tuán)隊提供。孜然粉，購于呼和浩特市華聯(lián)超市；沙蔥，購于鄂爾多斯市，于60℃條件下烘干，粉碎后過40 目篩得沙蔥粉，備用。

N-亞硝胺標(biāo)品、生物胺標(biāo)品，美國Sigma 公司；乙腈、丙酮、乙酸銨、冰乙酸、亞硝酸鈉、甲醇、正己烷、丹磺酰氯，呼和浩特市達(dá)音商貿(mào)有限公司。乙腈、丙酮、乙酸銨、冰乙酸、甲醇為色譜純級，其余為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260vwd 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-1800 型紫外-可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；日本EYELA MGS-2200C 氮吹儀，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；ZWYR-240 臺式真彩觸摸屏搖床，南京依貝儀器設(shè)備有限公司；DSH-300A 回旋式水域恒溫振蕩器，上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；ZXMP-A1430 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KDC-14DHR 離心機(jī)，Eppendorf 中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵羊肉香腸的加工方法 各試驗組發(fā)酵香腸的工藝流程如下：

原料肉→將瘦肉絞碎、肥肉切丁→攪拌均勻（加入輔料）→腌制→灌腸→發(fā)酵→干燥→成熟（成品）。具體步驟是：

1）腌制 各組分別稱取攪碎的羊后腿肉1 600 g 和大小為1 cm×1 cm×1 cm 左右的羊尾脂肪400 g，對照組加入蔗糖8 g，葡萄糖8 g，食鹽40 g，硝酸鈉112 mg，亞硝酸鈉112 mg。發(fā)酵劑組按107CFU/g 接種復(fù)合發(fā)酵劑，沙蔥+孜然組添加沙蔥32 g、孜然48 g，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組接種復(fù)合發(fā)酵劑并添加沙蔥32 g、孜然48 g。攪拌均勻后在4℃條件下腌制12 h；

2）灌腸 將每組腸餡分別灌入直徑為26 mm 的膠原蛋白腸衣中，制成10 cm 長的香腸；

3）發(fā)酵 將制好的香腸轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕箱中，于溫度30℃、相對濕度95%的條件下發(fā)酵48 h；

4）干燥 在溫度14℃、相對濕度85%條件下干燥72 h；

5）成熟 在溫度13℃、相對濕度75%條件下成熟72 h。

1.3.2 試驗設(shè)計本試驗設(shè)計分為4 組發(fā)酵香腸；對照組：不接種發(fā)酵劑、不添加沙蔥和孜然；發(fā)酵劑組：只接種復(fù)合發(fā)酵劑；沙蔥+孜然組：只加入沙蔥、孜然；沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組：接種復(fù)合發(fā)酵劑、添加沙蔥和孜然。

分別于腌制（0 d）、發(fā)酵（2 d）、干燥（5 d）、成熟（8 d）階段結(jié)束時取樣，測定pH 值、水分活度、微生物指標(biāo)、亞硝酸鹽、生物胺和N-亞硝胺。

1.3.3 pH 值、水分活度的測定pH 值參照GB 5009.237-2016《食品pH 值的測定》[16]測定；水分活度參照GB 5009.238-2016《食品水分活度的測定》[17]測定。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定 按照GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定發(fā)酵羊肉香腸中亞硝酸鹽的含量[18]。

1.3.5 生物胺含量的測定 按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的測定》測定羊肉發(fā)酵香腸中生物胺含量[19]。采用高效液相色譜儀聯(lián)合C18 柱子（柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）和紫外檢測器檢測生物胺的含量。樣品進(jìn)樣量20 μL，流動相流速0.8 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測波長254 nm。梯度洗脫程序：流動相A、B起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為60%，40%，保持22 min；第22 分鐘流動相A、B 分別為85%，15%，保持3 min；第25 分鐘流動相A 升至100%，保持7 min；第32.01 分鐘流動相A、B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，40%，保持至第37 分鐘。色流動相A 為90%乙腈-10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液），流動相B 為10%乙腈-90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液）。

1.3.6 亞硝胺含量的測定 參照的溫演慶等[20]的方法略作改進(jìn)。采用高效液相色譜儀聯(lián)合C18 柱子（柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）和紫外檢測器檢測。樣品進(jìn)樣量10 μL，流動相流速0.8 mL/min，柱溫40℃，紫外檢測波長230 nm。梯度洗脫程序：流動相A、B 起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為90%，10%，保持5 min；第5 分鐘流動相A、B分別為80%，20%，保持15 min；第20 分鐘流動相A 降至30%，保持10 min；第30 分鐘流動相A 降至20%，保持10 min；第40 分鐘流動相A、B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，10%，保持至第45 分鐘。流動相A 為緩沖液溶液，流動相B 為甲醇。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用軟件SPSS 18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性差異分析，每個試驗重復(fù)3 次。統(tǒng)計學(xué)顯著性分析P＜0.05 表示差異性顯著。采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸pH 值的影響

由圖1可看出，腌制結(jié)束后0 d，各組pH 值均在5.5 左右，無顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵結(jié)束后2 d，各組的pH 值降為最低值（P＜0.05）。其中發(fā)酵劑組pH 值降為4.69，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組pH 值最低為4.43。這可能是由于在發(fā)酵過程中，溫度升高，發(fā)酵劑迅速生長為香腸中的優(yōu)勢菌，增大了發(fā)酵速度，發(fā)酵劑代謝大量乳酸促使發(fā)酵香腸pH值下降。干燥階段（5 d）各組pH 值均升高且差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵劑組pH 值由4.64 升到4.84，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組pH 值由4.43 升到4.60。可能是沙蔥和孜然中的有效成分促進(jìn)微生物及肉組織中的酶發(fā)揮作用，使發(fā)酵香腸中產(chǎn)生了一些堿性的含氮物質(zhì)[21]。成熟后（8 d）各組pH 值均有適當(dāng)回升，可能是由于碳水化合物被消耗，乳酸菌利用含氮化合物以及蛋白酶發(fā)生降解，形成蛋白質(zhì)使堿性物質(zhì)濃度增加所引起[18]。總體來說，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組發(fā)酵香腸加工過程中pH 值顯著降低（P＜0.05），可以一定程度上抑制腐敗菌的生長，保證產(chǎn)品的安全性[22]。

圖1 加工過程中復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料處理組的發(fā)酵香腸pH 值的變化Fig.1 Changes of pH value on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.2 復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸水分活度的影響

低水分活度可提高發(fā)酵香腸貨架期和食用安全性。由圖2可知，隨著加工時間的變化，各組的aw值逐漸降低。腌制結(jié)束后0 d，各組發(fā)酵香腸的水分活度值在0.92 左右（P＜0.05）。發(fā)酵結(jié)束后2 d，發(fā)酵劑組的aw值為0.909，顯著低于其它組（P＜0.05）。在干燥結(jié)束后5 d，各組的aw值明顯下降（P＜0.05），且aw值均低于0.9。香腸成熟后8 d，各組的aw值明顯下降至0.8 左右（P＜0.05），可有效抑制腐敗微生物的生長。發(fā)酵劑組和沙蔥+孜然組的水分活度均低于對照組，水分活度的降低與pH值有關(guān)，pH 值的降低會使蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠化，香腸表面的水分會分散到空氣中，導(dǎo)致水分活度值降低[23]。

圖2 加工過程中復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料處理組發(fā)酵香腸水分活度的變化Fig.2 Changes of water activity on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.3 復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵羊肉香腸亞硝酸鹽的影響

由圖3可知，在香腸加工階段，隨著時間的延長，亞硝酸鹽含量逐漸降低，這與賈仁勇等[24]研究結(jié)果一致。在腌制結(jié)束后0 d，對照組和試驗組的亞硝酸鹽的含量差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵結(jié)束后2 d，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組亞硝酸鹽的含量顯著下降（P＜0.05）。在成熟結(jié)束8 d，試驗組亞硝酸鹽含量均低于對照組（P＜0.05），其中，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組為5.66 mg/kg，此時的aw值較低，微生物的作用小，亞硝酸鹽可能轉(zhuǎn)變成硝酸鹽，使亞硝酸鹽含量降低。以上說明孜然、沙蔥和發(fā)酵劑的共同作用使亞硝酸鹽減少效果最好。在試驗中添加的植物乳桿菌和戊糖片球菌起到關(guān)鍵作用，隨著pH 值的降低，亞硝酸鹽殘留量也降低，與梁鵬等[25]的研究結(jié)果一致。整個試驗過程中，各組的亞硝酸鹽殘留量低于國家規(guī)定30 mg/kg，亞硝酸鹽沒有超標(biāo)，保障了香腸的安全問題[26]。

圖3 加工過程中復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料處理組發(fā)酵香腸亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes in the contents of nitrite on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.4 復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵香腸加工過程中生物胺含量的影響

由圖4a所示，酪胺含量呈先升后降的趨勢，添加復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料可以抑制酪胺含量。在發(fā)酵結(jié)束2 d，各組的酪胺含量上升的速率明顯，說明這是具有酪氨酸脫羧酶活性菌株的活躍時期，可能是發(fā)酵階段環(huán)境溫度高，使具有脫羧酶的微生物活性增強，其中對照組酪胺含量顯著高于試驗組（P＜0.05）。干燥階段各組酪胺含量開始下降。至香腸成熟后8 d，發(fā)酵劑組、沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組發(fā)酵香腸酪胺含量顯著低于對照組（P＜0.05），其中發(fā)酵劑組的含量最低為9.746 mg/kg。前期研究表明，復(fù)合發(fā)酵劑菌株中的戊糖片球菌（37X-3）和植物乳桿菌（37X-6）具有降解酪胺的能力，減少發(fā)酵香腸中酪胺含量的積累[27]。與本研究類似，許女等[28]研究發(fā)現(xiàn)，接種植物乳桿菌到魚肉香腸中，可顯著降低生物胺的含量。有報道，香辛料對腐敗微生物具有一定的抑菌作用，而發(fā)酵肉制品中的生物胺一般由腐敗微生物（如腸桿菌、假單胞桿菌等）產(chǎn)生。沙蔥中存在著多糖、黃酮類化合物、生物堿和香精油等多種生物活性物質(zhì)，對微生物的生長具有很強的抑制作用[29]。馬夢梅等[30]研究表明孜然中特征成分有孜然精油、蛋白、多酚、膳食纖維等，其中孜然精油、多酚均有抑菌作用。李偉等[31]研究表明孜然精油成分主要有枯茗醛和2-蒈烯-10-醛、3-蒈烯-10-醛、γ-松油烯等，均具有較強的抑菌能力。因此，將發(fā)酵劑和香辛料添加到發(fā)酵肉制品中可有效降低酪胺的含量。

組胺是發(fā)酵肉制品常見的8 種生物胺中毒性最大的生物胺。由圖4b所示，組胺的含量總體上呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵階段（2 d）是組胺迅速積累的時期，干燥階段（5 d）各組的組胺含量顯著下降，發(fā)酵劑組的組胺含量最低為3.376 mg/kg。香腸成熟后（8 d），各組的組胺含量持續(xù)下降，發(fā)酵劑組未檢出組胺。前期研究表明，復(fù)合發(fā)酵劑菌株中的戊糖片球菌（37X-3）和植物乳桿菌（37X-6）具有降解組胺的能力，減少發(fā)酵香腸中組胺含量的積累[27]。沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組的組胺含量為3.289 mg/kg，顯著低于其它組（P＜0.05），說明添加發(fā)酵劑和香辛料降低發(fā)酵香腸中組胺含量的作用明顯。

腐胺和尸胺是發(fā)酵肉制品中最常見的生物胺。由圖4c 和圖4d 可看出，發(fā)酵階段（2 d）是腐胺和尸胺迅速積累的時期。香腸成熟后（8 d），各組腐胺、尸胺含量顯著下降（P＜0.05），發(fā)酵劑組腐胺、尸胺含量最低，顯著低于對照組（P＜0.05），且發(fā)酵劑組色胺未檢出，而香辛料對腐胺、尸胺沒有抑制作用。與本研究相類似，王德寶等[32]將復(fù)配發(fā)酵劑菌株接種到香腸中，可有效抑制尸胺、苯乙胺的形成。

發(fā)酵階段（2 d）是色胺（圖4e）和苯乙胺（圖4f）含量極具積累的階段，干燥階段（5 d）色胺含量緩慢增加，苯乙胺含量緩慢下降。添加發(fā)酵劑和香辛料對抑制苯乙胺和色胺的形成有明顯作用，成熟階段（8 d），各試驗組苯乙胺和色胺的含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。其中發(fā)酵劑組對苯乙胺、色胺抑制作用最明顯。精胺和亞精胺為肉中所固有胺類物質(zhì)，且在香腸加工過程含量變化小[33]，未對其加以分析。

圖4 加工過程中復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料處理組發(fā)酵香腸6 種生物胺含量的變化Fig.4 Changes in the contents of eight BAs on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

2.5 復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料對發(fā)酵香腸加工過程中亞硝胺含量的影響

目前NDMA 為肉制品中最主要的N-亞硝胺[34]。國級標(biāo)準(zhǔn)僅限量肉制品中NDMA 含量為3 μg/kg[35]。4 組發(fā)酵紅腸中7 種N-亞硝胺總量隨加工時間的變化如圖5a所示。本試驗中對照組成品中NDMA 含量6.125 μg/kg，超過國家標(biāo)準(zhǔn)，而試驗組未超過限量標(biāo)準(zhǔn)。NDMA 的含量總體呈先升高后降低的趨勢，添加復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料均可抑制NDMA 含量。腌制結(jié)束（0 d），對照組顯著高于試驗組（P＜0.05），沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組含量最低為2.698 μg/kg。干燥結(jié)束（5 d），NDMA 含量上升，而試驗組NDMA 含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。成熟結(jié)束（8d），各試驗組NDMA 含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中發(fā)酵劑組NDMA 含量最低為1.284 μg/kg、沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組NDMA 含量為1.605 μg/kg、沙蔥+孜然組NDMA 含量為1.656 μg/kg，說明添加發(fā)酵劑和香辛料可不同程度地減少NDMA 的含量，且發(fā)酵劑效果最好，這可能是由于發(fā)酵劑菌株產(chǎn)生可降解NDMA 的酶系[36]，或者菌體對NDMA 有吸附作用[37]。

對于除NDMA 以外的6 種N-亞硝胺，目前無國際限量標(biāo)準(zhǔn)。對于NDEA（圖5d），發(fā)酵后（2 d），發(fā)酵劑組NDEA 的最低含量為0.929 μg/kg，沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組、沙蔥+孜然組、對照組含量依次為1.143，1.197，2.414 μg/kg?？赡苁窃诎l(fā)酵階段，pH 值降到最低，乳酸菌對亞硝胺起到降解作用。香腸成熟后（8 d），對照組含量升高，試驗組NDEA 含量顯著低于對照組（P＜0.05），且沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組的最低含量為0.362 μg/kg，說明添加沙蔥+孜然和發(fā)酵劑的共同作用可減少NDEA 的含量。由圖5b 可知，成熟后各組NMOR 的含量降低，試驗組NMOR 含量均低于對照組，其中沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組NMOR 最低含量為1.160 μg/kg，可見發(fā)酵劑和香辛料共同作用下效果最好。由圖5e 可知，成熟后（8 d），試驗組NPIP 含量均顯著低于對照組（P＜0.05），說明發(fā)酵劑組和香辛料均可減少NPIP 的含量。而對于NPYR（圖5c）、NDPA（圖5f）和NDBA（圖5g），在不同加工階段各組的含量并未呈較一致的規(guī)律性。

圖5 加工過程中復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料不同處理組發(fā)酵香腸7 種亞硝胺含量的變化Fig.5 Changes in the contents of seven nitrosamine on fermented sausages processed with different treatments of compound starter and spice

3 結(jié)論

添加復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料可有效抑制發(fā)酵香腸加工過程中4 種N-亞硝胺（NDMA、NDEA、NMOR 和NPIP）以及6 種生物胺（酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）的積累，且沙蔥+孜然+發(fā)酵劑組效果最好。發(fā)酵劑和香辛料共同作用還可促進(jìn)發(fā)酵香腸pH 值和水分活度的降低，亞硝酸鹽含量降至5.66 mg/kg。將復(fù)合發(fā)酵劑和香辛料應(yīng)用到發(fā)酵香腸的生產(chǎn)中，既可抑制發(fā)酵香腸中生物胺的積累又可改善發(fā)酵香腸品質(zhì)。